34 En esta gráfica se muestra la absorbancia de una solución de luteína irradiada con luz fotosintéticamente activa (1000 y 1600 mol m-2 s-1) proveniente de lámparas a diferentes tiempos de exposición. En ambas intensidades de luz y a dos horas de irradiación se observa el mayor incremento en la absorbancia de la solución de luteína respecto al tratamiento no irradiado.
7.3 Efecto de 2 ambientes contrastantes de radiación solar en la biosíntesis de
35 total de carotenoides fue mayor en las plantas del invernadero de plástico (3.12, ± 1.18401 g kg-1) que en el invernadero de vidrio (2.14, ± 0.57 g kg-1) (t(0.05, 18) = 2.34).
Diferentes carotenoides fueron detectados en las inflorescencias de ambos invernaderos, por ejemplo en el invernadero de plástico se detectó: violaxantina, tres isómeros de cis-luteína 5,6-epoxido, aloxantina, cis-luteína y dos isomeros de cis- zeaxantina, mientras que en el invernadero de vidrio se detectarón: cis-luteína-epóxido, un aparente epoxi-caroteno, cis-luteína 5,6-epóxido, cis-anteraxantina, cis-luteína y cis-zeaxantina (Tablas 3, 4; Gráficas 4,5; Figura 5 y 6).
Tabla 3. Datos cromatográficos y espectroscópicos de carotenoides encontrados en inflorescencias de T.erecta , cultivadas bajo un invernadero con cubierta plástica.
Tiempo de
retención (min.) Ilλ* IIIλ* λcis* III/II % CIS/II % Concentración mg ml-1
Carotenoide propuesto 4.94 440.6 469.7 63.0 0.03744 cis-luteìna-5,6-
epoxidó
5.36 441.8 470.9 335.1 88.9 3.7 0.04524 cis-violaxantina 6.57 441.8 469.7 312.5 92.4 5.6 0.03744 cis-violaxantina
7.05 439.4 469.0 314.9 56.8 38.2 0.04992 cis-neoxantina 7.40 449.1 478.2 301.8 38.9 16.1 0.06084 cis-zeaxantina 7.72 449.1 478.2 311.3 80.3 2.5 0.06396 cis-zeaxantina 10.28 446.7 474.5 332.8 52.9 4.4 13.87464 cis-luteína 11.45 451.5 478.2 339.9 26.1 3.4 0.36192 cis-zeaxantina
* Según Britton (1995); Ilλ* longitud de onda del segundo pico del espectro visible del carotenoide; IIIλ* longitud de onda del tercer pico del espectro visible del carotenoide;
λcis* longitud de onda del pico cis del espectro uv-visible del carotenoide.
36 Tabla 4. Datos cromatográficos y espectroscópicos de carotenoides encontrados en inflorescencias de T.erecta, cultivadas bajo un invernadero con cubierta de vidrio.
Tiempo de
retención en min. Ilλ* IIIλ* λcis* III/II % CIS/II % Concentración g kg-1
Carotenoide Propuesto 5.191 439.4 469.7 365.0 104.4 7.70 0.05457 cis-luteína-5,6-
epóxido
6.359 441.8 470.9 119.0 0.05029 Violaxantina 6.869 440.6 469.7 329.2 93.6 18.79 0.1177 cis-luteína 5,6-
epóxido 7.488 443.0 472.1 329.2 8.5 456.79 0.15515 cis-
anteraxantina 8.107 444.0 467.0 338.0 9.90 0.05671 cis-
anteraxantina 10.067 447.9 474.5 334.0 52.0 3.34 8.9773 cis-luteína 11.236 452.0 478.2 343.5 21.7 5.04 0.31779 cis-zeaxantina
*Notacion según Britton (1995); Ilλ* longitud de onda del segundo pico del espectro visible del carotenoide; IIIλ* longitud de onda del tercer pico del espectro visible del carotenoide; λcis* longitud de onda del pico cis del espectro uv-visible del carotenoide.
En las tablas 5 y 6 se muestra información de HPLC con arreglo de diodos y la estructura fina espectral (Britton, 1995) de las especies químicas de carotenoides encontrados en las inflorescencias de T. erecta cultivadas en invernaderos con diferente tipo de cubiertas.
37 Tabla 5. Efecto sobre algunos caracteres morfológicos y concentración de
carotenoides en inflorescencias de T. erecta L. cultivadas bajo 2 distintas cubiertas.
PARÁMETERO CUVIERTA DE PLASTICO CUVIERTA DE VIDRIO
Diámetro (cm) 8.1a* 6.77 b
Peso seco de lígulas (g) 0.624 c 0.46 d
Concentración de xantofilas 6.24 e 4.56 f totales (g/kg )
*Letras diferentes en el mismo renglón indican diferencias significativa según Tukey, P
≤ 0.05.
Las diferentes cubiertas de los invernaderos modifican la luz solar incidente en las plantas, por ejemplo la cubierta plástica reduce la RFA y reduce la mayoría de la radiación UV. Estas modificaciones de la luz inducen diferencias en parámetros de las plantas como el diámetro de las inflorescencias, peso seco de lígulas y la concentración de xantofilas.
38 Figura 5 a y b. Desplazamiento químico de 13C de caroteoides: epóxido (a) y aleno (b), encontrados en lígulas provenientes del invernadero con cubierta de plástico.
a) b)
R O
HO
124.7
132.2 134.3 12.9
137.5 123.8 70.4
20.1 25.1 29.6
41.1
64.3 35.4
68.8 70.9
20.9 123.6 29.6
25.4
137.1 134.3
63.3 36.4
14
131.3 124.9 41.2
C
R
HO OH
202.3
125.2 128.4
132.2 14 103.2 32.2 29.4
31.4
73 49 64.2 49.5
35.2
199.19 105
117.2 118.2
31.86 29.3
14
128.36 131.32
125.2
48.32 32.7
36.4
48.3
63.3
Figura 6 a y b. Desplazamiento químico de 13C de caroteoides: aleno (a) y epóxido (b) y encontrados en lígulas provenientes del invernadero con cubierta de vidrio. Los valores en color negro son los datos reportados por Englert (1999) y los valores en itálica, son los valores obtenidos experimentalmente en este trabajo.
C
R
HO OH
202.3
125.2 128.4
132.2 14 103.2 32.2 29.4
31.4
73 49 64.2 49.5
35.2
202.2 117.2
31.86 29.2
14
128.36 131.32
125.2
74.4 48.32 32.2
36.4
49.5
63.3
R O
HO
124.7
132.2 134.3 12.9
137.5 123.8 70.4
20.1 25.1 29.6
41.1
64.3 35.4 47.2
68.8 70.4
69.7 20.8
123.9
137.2 134.3 29.6 12.7
25.2 41.01
45.3
63.31 35.5
131.3 124.9
a) b)
39 7.4 Efecto de la radiación fotosintéticamente activa en carotenoides de lígulas de T. erecta L.
En general las inflorescencias irradiadas a 1600 mol m-2 s-1 y a cualquiera de los tiempos de irradiación, presentaron menor concentración de carotenoides (5.67 ± 1.48 g kg-1 por kilogramo de harina) que el grupo de las inflorescencias irradiadas a 1000
mol m-2 s-1 (7.68, ± 1.25 g kg-1 por kilogramo de harina) (t(0.05,46)= 5.12). Sin embargo, el tratamiento donde se presentó la mayor concentración de carotenoides fue 1000
mol m-2 s-1 durante 6 h (8.85 ± 1.22 g kg-1 por kilogramo de harina) y el que presentó menor concentración (4.37 ± 1.03 g kg-1) fue el de 1600 mol m-2 s-1 y 4 h de irradiación. Sin embargo, en ambos grupos de irradiación se presentaron mayor concentración de carotenoides que el grupo no irradiado (2.4 ± 0.57 g kg-1 por kilogramo de harina), (Gráfica 3).
Gráfica 3. Efecto de la irradiación con RFA artificial en inflorescencias de T.erecta L.
0 2 4 6
2 4 6 8 1 0
g/kg
h o r a s
1 0 0 0 m o l m- 2 s- 1
0 2 4 6
2 4 6 8 1 0
g/kg
h o r a s
1 6 0 0 m o l m- 2 s-1
40 En forma general el tratamiento de 1000 mol m-2s-1 indujo la mayor concentración de xantofilas totales.
40 En forma general el tratamiento de 1000 mol m-2s-1 indujo la mayor concentración de xantofilas totales.
8 Discusión.
Cuando los carotenoides como la luteína y la zexantina son irradiadas con RFA solar o artificial, estas moléculas están sujetas a transformaciones fotoquímicas. Este hecho se ha descrito en trabajos previos (Handelman, 1991; Siems, 1999), sin embargo en estos, no se midió la cantidad de RFA; ni la temperatura fue controlada.
Se encontró una relación lineal negativa entre la absorbancia de la solución de luteína y la irradiación solar. Sin embargo, bajo algunas condiciones de irradiación, la solución de luteína puede presentar incrementos en la absorbancia. Este efecto se observo en la solución de luteína expuesta a luz solar y artificial. Esto puede ser explicado en términos de rotación de un anillo de la luteína, de tal forma que se establece un doble enlace adicional, además de isomerización cis-trans (ver figura 7). Estas fototransformaciones de carotenoides afectan tanto la absorbancia como el tiempo de retención en la cromatografía.
En la solución de luteína irradiada, se encontró evidencia de fototransformación de luteína a zeaxantina, así como, a moléculas nuevas en la solución como epoxi- carotenoides y carotenoides alénicos. Por ejemplo con irradiación artificial a 1000 mol m-2 s-1 y después de 4 horas de exposición, se detectó una molécula tipo neoxantina.
Los datos con los que contamos, sugieren que tanto la luteína y la zeaxantina irradiadas pueden ser el origen de estos alenos y epóxidos, sin embargo, aún no determinamos el mecanismo de reacción, lo cual puede ser tema para futuros trabajos.
Al respecto la luteína presenta cambios más drásticos de área relativa que la zeaxantina; esto sugiere reacciones fotoquímicas en las cuales la luteína es transformada a neoxantina u otro intermediario del ciclo de la zeaxantina. Esta última
41 reacción tiene implicaciones fisiológicas, por que establecería una nueva ruta metabólica que puede conectar la gran cantidad de reservas de luteína y ser utilizadas por la planta en estres por estar bajo exceso de iluminación. Lo anterior puede incrementar la eficiencia del ciclo de la zeaxantina y la biosíntesis de ABA. Además, la propia luteína puede ser autoepoxidada y entrar en un ciclo luteína luteína-5,6- epoxido y este ciclo también puede ayudar a la disipación del exceso de energía por la planta. Sin embargo, con los datos con los que se cuenta, no se puede excluir la posibilidad que estas transformaciones de la luteína sean reacciones fotoquímicas- enzimáticas en la planta. Por lo que es importante desarrollar investigación al respecto.
Los estudios realizados en plantas dentro de los 2 tipos de invernaderos, demuestran que estas cubiertas modifican la luz incidente en las plantas, en cantidad y calidad.
Estos ambientes de luz afectan en forma significativa la morfología y fisiología de las inflorescencias de T.erecta. En el presente estudio la RFA y radiación UV, fueron más intensos en el invernadero con cubierta de vidrio que en el de plástico. Lo anterior condujo a una reducción del diámetro de las inflorescencias, peso seco de lígulas y contenido de carotenoides en las plantas cultivadas en el invernadero con cubierta de vidrio, en contraste con el invernadero con cubierta plástica. Mas aun, estos resultados bajo estos tipos de luz sugieren fuertemente que la cantidad y especies químicas de carotenoides se ven afectados fuertemente en las inflorescencias de esta planta.
En las lígulas provenientes de ambos invernaderos, detectamos epoxi-luteína y metabolítos componentes del ciclo de la zexantina-anteraxantina. Esto es un resultado interesante por que Bungard et al (2) demostraron que la luteína se puede auto- epoxidar mediante determinada condición de RFA y des-epoxidar cuando el estímulo luminoso se detenía y que este ciclo puede ayudar a la planta a disipar el exceso de energía luminosa. También se encontró en nuestro estudio que la luteína es el carotenoide más abundante y que la zexantina se presenta en menor cantidad independientemente de las condiciones de irradiación.
42 En muestras de carotenos provenientes de lígulas del invernadero con cubierta de vidrio, las áreas relativas de los picos obtenidos por HPLC de los epoxi-carotenoides, fueron menores que los correspondientes de la zexantina (2.08:2.97) y mucho mas bajo en el invernadero con cubierta de plástico (0.85:2.32). En otras palabras la concentración relativa de los epoxi-carotenoides es mayor donde las condiciones de irradiación solar fueron mas severas e intensas, sugiriendo con esto que la puesta en marcha del ciclo de luteína-epoxiluteína depende tanto de la cantidad como de la calidad de luz incidente.
Sin embargo, bajo las condiciones de luz dentro del invernadero de vidrio, el ciclo de la zexantina-violaxantina y el de la luteína-epoxiluteína pueden trabajar juntos para disipar el exceso de energía luminosa. Pero, en el invernadero con cubierta plástica nuestros datos sugieren que el principal ciclo es el de zeaxantina-anteraxantina. Esto implica que T.erecta, tiene una gran cantidad de luteína que puede utilizar para disipar el exceso de energía luminosa mediante el ciclo luteína-epoxluteína en adición al ciclo de la zeaxantina. Si se compara la concentración de luteína y sus correspondientes datos de HPLC de las lígulas obtenidas en ambos invernaderos, la concentración de luteína es menor en el invernadero de vidrio que en el de plástico. Entonces surge una pregunta:
¿Qué pasa con la diferencia de luteína?, se inhibe su biosíntesis o sufre transformaciones fotoquímicas o bien fotoquímicas-enzimáticas? de tal forma que cierta fracción de luteína es transformada en zexantina y otras especies de carotenoides. En relación a lo anterior, las diferencias del area relativa del pico de HPLC correspondiente a zeaxantina, luteína y otros carotenoides de las lígulas de ambos invernaderos son aproximadamente de 0.65%, 4.95% and 4.11%, respectivamente, siendo 4.76 % la suma de la zeaxantina y otros carotenoides exceptuando a la luteína.
Por lo tanto, la luteína puede ser la fuente del incremento de la zeaxantina y epoxi- carotenoides, dado que 4.95 – 4.76 = 0.19, por lo que la diferencia de la cantidad de luteína es suficiente para los incrementos de zeaxantina y otros carotenoides. Esto es un punto interesante para futuras investigaciones por que la luteína (un -caroteno) es
43 el principal carotenoide almacenado en plantas y puede ser sujeta a transformaciones fotoquímicas o fotoquímicas-enzimáticas para producir un carotenoide o carotenoides de la rama de los -carotenoides y establecer una conexión entre ambas ramas (Figura 8). Otro aspecto importante que hay que mencionar es que la biosíntesis de carotenoides en lígulas de T.erecta, se ve afectada por distintas intensidades y en pocas horas de irradiación con RFA, como lo demuestra el experimento de irradiación artificial en condiciones in vivo.
Por otro lado, tomando en cuenta los sistemas de análisis de carotenoides como el que se utilizó en este trabajo, hace falta el desarrollo de métodos de análisis que consuman menos tiempo y de preferencia poco o ningún disolvente orgánico, los cuales pueden constituir problemas de contaminación, además de que en el caso del análisis masivo de muestras se convierten en un fuerte gasto económico. Por lo tanto, se desarrolló un sistema de análisis de carotenoides en lígulas frescas in vivo, así como, en harina de este tejido. Este sistema se basa en la espectroscopia RAMAN, para abundar en el tema se pide al lector revise el anexo 1 de este manuscrito.
Figura 7. Rotación de propuesta de un anillo de luteína inducida por luz
HO
OH
HO
OH
hv
44 En determinadas condiciones de irradiación artificial de luteína en solución, se presenta un incremento en la absorbancia, el cual puede ser explicado por la rotación de un anillo de la luteína, de tal forma que se establece un doble enlace más.
Figura 8.- Ruta propuesta de conexión entre luteína y la rama de los -carotenoides.
DMADP
FITOENO
LICOPENO
-CAROTENO MEVALONATO
RUTA DOXP
CAROTENO
CAROTENO
ZEINOXANTINA ZEAXANTINA
ANTERAXANTINA
VIOLAXANTINA
NEOXANTINA
ABA LUTEINA
LUTEINA-5,6-EPOXIDO
Conexión
fotoquímico-enzimatica?
45 9 Conclusión.
La biosíntesis de carotenoides en T.erecta, es dramáticamente afectada por la cantidad de luz, calidad y tiempo de irradiación. Puesto que controlando estos parámetros, se puede incrementar el diámetro de inflorescencias, peso seco de las lígulas y la concentración de carotenoides (lo cual se demuestra en el uso de los dos tipos de invernaderos). En los experimentos con irradiación artificial utilizados in vivo, aplicada a inflorescencias, la concentración de carotenoides presenta una función compleja no lineal, En general utilizando una irradiación de 1000 mol m-2 s-1 entre 2 y 8 horas de exposición, se induce una concentración mas alta que la obtenida con 1600 mol m-2 s-
1 y los mismos tiempos, siendo 1000 mol m-2 s-1 y 6 horas de irradiación, las condiciones donde se presenta la mayor concentración de carotenoides, pero tanto a 1000 mol m-2 s-1 como 1600 mol m-2 s-1 presentan mayor concentración que en los tratamientos no irradiados. Además, con las condiciones de irradiación indicadas se presentan especies químicas de carotenoides no pre-existentes.
Por otro lado, bajo ciertas condiciones de irradiación indicadas en este trabajo, aplicadas a carotenoides en solución, se presenta un incremento en la absorbancia, lo cual es factible de explicar en términos de incremento de dobles enlaces e isomería cis de las moléculas en cuestión.
46 10 Recomendaciones y sugerencias.
El estudio del efecto de la luz sobre la fisiología de las plantas es un aspecto de suma importancia y en la medida que se comprenda mejor, los fenómenos producidos por la irradiación luminosa en las plantas se podrán proponer soluciones o mejoras en la productividad de los vegetales cultivados. Se debe realizar estudios tanto del efecto de diferentes cantidades de fotones, como de diferentes longitudes de onda de esos fotones y por supuesto estudiar el efecto de lo anterior en combinación con otros factores que afectan el desarrollo de las plantas como: nutrición, temperatura, irrigación, humedad relativa, concentración de CO2 y reguladores del crecimiento.
En este trabajo se demuestra que la concentración de carotenoides en lígulas de T.erecta se incrementa entre 800 y 1600 µmol m2 s-1 de RFA aun cuando se requiere de afinar mas este rango mediante el establecimiento de experimentos variando la intensidad de irradiación luminosa. Además, se propone una conexión de la rama de los α-carotenos con la rama de los β-carotenos mediante reacciones fotoquímicas, pero no se excluye la posibilidad de mecanismos ezimático-fotoquímicos los cuales se han descrito (p.e. ciclo de la zeaxantina).
Siendo México el centro de origen de Tagetes erecta L. (Serrato,2004), se puede encontrar una gran diversidad genética de esta especie, lo cual es fundamental para iniciar cualquier programa de mejoramiento genético y de esta manera poder generar variedades e híbridos que permitan a, agricultores e industriales mexicanos competir a nivel mundial. Sin embargo, es también importante determinar los nichos agroecológicos donde se pueda cultivar esta planta y se pueda expresar así competitivamente la biosíntesis de carotenoides.
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