Los extractos polifenólicos presentan una amplia gama de polifenoles desde monómeros de bajo peso molecular hasta polímeros de alto peso molecular (Segovia, 2018). En ese sentido, determinar el contenido de cada polifenol en particular es una tarea muy compleja que demandaría muchos análisis de cromatografía liquida. Frente a este escenario, se han establecido métodos de cuantificación que permiten determinar de forma rápida el contenido de polifenoles totales como el método de Folin Ciocalteu, el cual fue propuesto por Singleton y Rossi (1965).
El método se basa en la reacción de los compuestos fenólicos con el reactivo de Folin-Ciocalteu dando lugar a una coloración azul susceptible de ser determinada espectrofotométricamente a 765 nm. Sin embargo, para poder medir el contenido de polifenoles totales presente en los extractos es necesario previamente construir una curva estándar usando ácido gálico como polifenol equivalente. Esto permite establecer una ecuación lineal que finalmente determinará el contenido de polifenoles totales presentes en los extractos obtenidos, los mismos que serán expresados como en mg de ácido gálico equivale/100 gr o mL de muestra.
La Tabla 4, muestra los resultados de absorbancia del presente trabajo cuyas concentraciones varían de 4 a 20 mg/L con absorbancias entre 0.11 y 0.52. Si bien las concentraciones de ácido gálico (polifenol equivalente)
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usadas en este trabajo de investigación distan de otras concentraciones usadas en otros trabajos de investigación (Tabla 4), cuyas diferencias probablemente se deban a la pureza del polifenol equivalente al momento de preparar la curva estándar. Sin embargo, la ley de Lambert – Beer establece que los valores de absorbancia no deben superar el valor de 0.85 debido a la linealidad de la curva obtenida. En ese sentido podemos observar que nuestros parámetros están dentro del rango establecido.
Tabla 4
Comparación de los resultados de curvas de calibración versus otros autores
Tesis Paladino (2007) Dueñas (2017)
mg/L Absorbancia mg/L Absorbancia mg/L Absorbancia
0 0 0 0 0 0
4 0.1186 50 0.097 20.2 0.086
8 0.2089 10 0.2016 60.2 0.369
12 0.3378 150 0.2801 100.2 0.887
16 0.4141 250 0.4216 140.2 1.239
20 0.519 500 0.7878
Otro aspecto importante de la construcción de la curva estándar es poder establecer una ecuación lineal que permita determinar el contenido de polifenoles presentes en los extractos polifenólicos obtenidos. Esta ecuación lineal debe ser validada mediante el ajuste del R2 cuyo valor debe ser superior a 0.9 (Figura 14).
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Figura 14: Regresiones obtenidas de la preparación de la curva de calibración
Los resultados del efecto de la temperatura (50°C y 70°C) y concentración de etanol (30, 60 y 90%) sobre el contenido de polifenoles se muestran en la Tabla 5. Un incremento en la temperatura de extracción de 50 a 70°C incrementa la recuperación de polifenoles totales expresados como mg de equivalente de ácido gálico por gramo de solido seco (EAG/gss) en un 23%, 36% y 31% para con las concentraciones de etanol de 30%, 60% y 90%, respectivamente (Tabla 5).
Concentración (mg/L)
0 100 200 300 400 500 600
Absorbancia
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
Tesis (2020) Paladino (2007) Dueñas (2017) y = 0.0465x + 0.0328
R2 = 0.9964
y = 0.010x - 0.13 R2 = 0.9957 y = 0.031x + 0.0003
R2 = 0.9964
68 Tabla 5
Determinación del contenido de polifenoles
Etanol (%) Temperatura (°C) Polifenoles (mg EAG/g)
Incremento (%)
30 50 2.91a ± 0.27
70 3.58b ± 0.28 23
60 50 6.63c ± 0.85
70 9.04d ± 0.53 36
90 50 7.52e ± 0.42
70 9.87f ± 0.06 31
El análisis de varianza ANOVA muestra que los factores estudio independientes (temperatura y concentración de etanol) así como sus interacciones presentan diferencias estadísticas significativas (p-valor <0.05) sobre la variable respuesta, consecuentemente se puede establecer que existe influencia de estos factores estudio sobre el contenido de polifenoles (Anexo 5). La prueba de comparación Tukey permitió establecer cuales medias son significativamente diferentes de otras, demostrando que existen 3 grupos homogéneos diferentes tales como A, B y C para la concentración de etanol de 30, 60 y 90%, respectivamente. Asimismo, este análisis de comparación también permitió definir que existen 2 grupos homogéneos diferentes A y B para la temperatura de extracción de 50 y 70°C respectivamente (Anexo 6).
El efecto positivo del uso de etanol sobre el contenido de polifenoles reportados en este trabajo (Tabla 4), también ha sido reportado por otros trabajos de investigación. Por ejemplo, Gómez et al. (2014), mencionan que
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un incremento en la concentración de etanol de 40 a 80% mejora en un 16%
y 32% la recuperación de taninos (polifenoles) usando temperaturas de 40 y 80 °C a partir de semillas de palta respectivamente. Al respecto, Do et al.
(2014) mencionan que independiente de la temperatura, el uso de mezclas agua-etanol ha demostrado ser más eficiente en la recuperación de polifenoles en comparación con el uso de agua pura bajo las mismas condiciones, debido a una mayor afinidad del polifenol por el etanol.
Si bien el uso de agua pura como solvente de extracción permite tener un solvente de extracción polar (Ɛ=80) con una mayor afinidad por compuestos polares, la adición de etanol (Ɛ=24) permitiría reducir la polaridad del solvente favoreciendo la afinidad por compuestos medianamente polares como los polifenoles (Wei-Na and Jun-Hong, 2014; Waszkowiak and Gliszczynska-Swiglo, 2016). Esta reducción de polaridad en el solvente de extracción favorece las interacciones entre el polifenol y el solvente, debido a que el etanol presenta en su estructura química grupos hidroxilo (fracción polar) y un grupo etilo (fracción no polar), los cuales pueden establecer interacciones tipo puentes de hidrogeno y dipolo-dipolo inducido con los grupos hidroxilo y anillo fenólico de los polifenoles respectivamente (Galanakis et al., 2013).
De forma similar, los incrementos de temperatura durante el proceso también favorecieron la recuperación de polifenoles (Tabla 5). Al respecto, diversos autores mencionan que los incrementos de temperatura mejoran la difusión de las moléculas de solvente dentro de la matriz vegetal debido a un incremento en la energía cinética del solvente; esto permite que el solvente rompa la estructura de las células vegetales liberando los polifenoles a la solución (Gonzales et al., 2010; Escribano-Bailon and Santos-Buelga, 2003).
70
La mejor condición de extracción fue establecida con 70 °C y 90% de etanol a 500 rpm por un periodo de 4 h, cuyo valor promedio fue de 9.87 mg EAG/gss (Tabla 5). Los resultados obtenidos son relativamente menores en comparación con otros valores reportados por otros autores. Por ejemplo, Gómez et al. (2014), reportaron que el uso de etanol al 80% a 80 °C en un proceso de extracción convencional (2500 rpm, 100 min) permitió una recuperación de ~46 mg EAG/gss de taninos a partir de semilla de palta liofilizada variedad Hass. Estas diferencias encontradas en la recuperación de polifenoles probablemente se deban al tipo de conservación de la muestra previo al proceso de extracción, así como la particularidad de la variedad de la semilla de palta y las condiciones de proceso.
4.2. Efecto de la temperatura y concentración de etanol sobre la