ENSAYOS EN SÍNTESIS DE LA ACTIVIDAD LIPASA

Además de su capacidad de aceptar una amplia gama de sustratos, algunas lipasas son también capaces de llevar a cabo reacciones de síntesis cuando se emplea solvente orgánico en lugar de agua como medio de reacción. Por lo tanto es necesario inmovilizar la actividad presente en los extractos enzimáticos o bien emplear el fermento sólido seco directo en la reacción. A continuación se describen los resultados obtenidos a partir de la inmovilización, en la trans-esterificación de vinil propionato en dipropionato de luteína (DPrL) y en la esterificación directa del ácido oleico con n- butanol, iso-butanol, sec-butanol y ter-butanol.

3.3.1. Cinética de inmovilización de la actividad lipasa sobre pNPP

Con el fin de poder evaluar la capacidad de síntesis de la actividad enzimática presente en el extracto crudo en presencia de solvente, fue necesario inmovilizarla. En la Figura 3.11 se muestra la cinética de adsorción de la actividad sobre pNPP presente en el extracto crudo de A. ochraceus producido por FMS sobre bagazo de caña. En la cinética se puede observar que a partir de las 10h, la actividad presente en el sobrenadante ya no desciende más, indicando que el proceso de adsorción ha terminado. La actividad del inmovilizado seco sobre pNPP fue de 40 U/g y el rendimiento fue del 30%.

Fernandes da Silva y cols. (2009) realizaron la inmovilización de un extracto enzimático de A. niger empleando diferentes soportes como Accurel EP-100®, Celita y sílica gel llegando a rendimientos de 37%, 32% y 16%, respectivamente [131], los cuales son parecidos a los obtenidos con en este trabajo y son típicos de ensayos preliminares de inmovilización ya que gran parte de la enzima diana puede adsorberse en una conformación poco activa o bien desnaturalizarse en el proceso.

Figura 3.11. Actividad relativa del sobrenadante sobre pNPP durante la inmovilización de la lipasa presente en el extracto crudo de A. ochraceus producido por FMS en bagazo de caña. La actividad se determinó por triplicado a 30°C.

Tiempo (h)

0 5 10 15 20

Actividad Relativa (%)

0 20 40 60 80 100

63

3.3.2. Síntesis de ésteres del ácido oleico a partir de n-butanol, iso-butanol, sec-butanol y ter- butanol

En los ensayos preliminares se llevó a cabo la esterificación del ácido oleico con el n-propanol, iso- propanol y ter-butanol demostrándose la capacidad de síntesis del bagazo de caña fermentado con A.

ochraceus. En este experimento se decidió utilizar alcoholes que fueran isómeros con el grupo hidroxilo en la posición primaria, secundaria y terciaria. El alcohol más pequeño que cumple con esa condición es el butanol, por lo que se llevó a cabo la síntesis de ésteres del ácido oleico a partir de n- butanol, isobutanol (2-metilpropanol), sec-butanol (2-butanol) y ter-butanol (2-metil-2-propanol).

Como biocatalizador se empleó el bagazo de caña con aceite de oliva seco obtenido a partir de la FMS con A. ochraceus (BC + Oliva), el bagazo de caña con cascarilla de maíz seco obtenido también de una FMS (BC +CM), el extracto crudo inmovilizado (Imm EC), el extracto crudo delipidado e inmovilizado (Imm EC delip.) y como testigos: las lipasas de Thermomyces lanuginosus (TLL), Pseudomonas cepacea (PCL), lipasas A y B de Candida antárctica (CALB y CALA), Rhizomucor miehei (RML), Carica papaya (CPL), Aspergillus niger (ANL), la lipasa pancreática porcina (PPL) y la lipasa de Candida rugosa (CRL) y Lewatit CNP105® activado (LW) como testigo negativo. En la Figura 3.12 se muestra un gráfico de actividad relativa con las diferentes muestras y los distintos alcoholes. En el caso del ter-butanol las conversiones fueron muy bajas y la velocidad inicial no pudo determinarse. La actividad mostrada en la síntesis del butil oleato (barras azules) con cada muestra se tomó como el 100%. Se puede apreciar que para BC +Oliva, BC + CM, TLL, PCL, CALB y RML la actividad en la síntesis del isobutil oleato (barras rojas) fue mayor que la observada para butil oleato. En el caso de BC + CM fue cerca de 6.5 veces mayor seguida de RML, donde fue 4 veces mayor. Sólo pocas muestras mostraron actividad

>50% con el alcohol secundario (barras verdes), entre las que destacaron CALA, BC+Oliva, Imm EC delip., y CALB. Resulta bastante interesante el hecho de que el bagazo de caña con oliva y el inmovilizado del extracto delipidado hayan llevado a cabo la síntesis del sec-butil oleato casi con la misma actividad que el butil y el isobutil oleato.

0 100 200 300 400 500 600 700

Actividad Relativa (%)

butil oleato isobutil oleato sec-butil oleato

64

Figura 3.12. Actividad relativa obtenida con las diferentes muestras en la síntesis de butil, isobutil y sec-butil oleato. La reacción se llevó a cabo en hexano, a 50°C, con una relación molar 1:1.5 ácido:

alcohol y con agitación magnética a 500 RPM. La actividad de síntesis del butil oleato (barras azules) se consideraron como el 100% de la actividad.

Por otra parte, en la Tabla 3.3 se resumen los valores de actividad y de conversión obtenidos a partir de las diferentes muestras. Es evidente que las muestras obtenidas a partir de A. ochraceus mostraron un comportamiento muy similar a aquel mostrado por CALA y ANL. Además mientras que la actividad mostrada por la mayoría de los preparados enzimáticos comerciales fue del orden de cientos o miles de U/g, en el caso de las muestras de A. ochraceus, CPL, ANL, PPL, CALA, PCL y CRL sólo fue de 1 U/g a unas cuantas decenas de U/g. Esto es de esperarse si se toma en cuenta la actividad que poseía el extracto crudo a partir del cual se elaboró el preparado enzimático, la eficiencia de inmovilización alcanzada y la actividad específica de cada enzima. De las muestras obtenidas a partir de A. ochraceus BC + Oliva fue la que obtuvo las mayores conversiones para la síntesis de butil oleato, isobutil oleato y sec-butil oleato, las cuales fueron 97%, 97% y 19%

respectivamente. Todos los testigos empleados alcanzaron conversiones mayores al 90% en las síntesis del butil e isobutil oleato con excepción de CALA y ANL quienes sólo alcanzaron valores menores al 40% de conversión. ANL apenas mostró indicios de haber reaccionado alcanzando conversiones apenas superiores al 5%.

Tabla 3.3. Actividad y conversión a tiempo final en la esterificación del ácido oleico empleando n- butanol, isobutanol, sec-butanol y ter-butanol como nucleófilos. La reacción se llevó a cabo a 50°C, con una concentración de 100 mM de ácido y una relación molar 1:1.5 ácido: alcohol.

MUESTRAS

Butil Oleato Isobutil Oleato Sec-butil Oleato Ter-butil Oleato Actividad

(U/g)

Conversión (%)

Actividad (U/g)

Conversión (%)

Actividad (U/g)

Conversión (%)

Actividad (U/g)

Conversión (%)

BC + Oliva 1.52 97 1.92 97 1.36 19 ND 0

BC + CM 0.16 10 1.04 22 ND ND ND 0

Imm EC 1.68 42 0.72 50 0.08 6 0

Imm EC delip. 1.12 76 0.96 77 0.64 6 ND 0

TLL 988 96 2140 99 56 37 ND 9

PCL 31.28 100 40.72 98 0.16 31 ND 1

CALB 764 91 1708 96 208 97 ND 3

CALA 1.04 20 0.36 38 1.4 30 ND 8

RML 412 92 1564 99 16 5 ND 1

CPL 69.4 100 106 99 6.6 27 ND 0.2

ANL 0.68 6 0.53 3 0.004 2 ND 0

PPL 11.16 99 8.6 99 0.08 27 ND 0.2

CRL 45.28 99 15.4 98 8.2 94 ND 10

LW ND 6 ND 4 ND 0 ND 0

65

En la Figura 3.13 se muestran las cromatografías de capa fina de las reacciones de síntesis del butil oleato (A), isobutil oleato (B), sec-butil oleato (C) y ter-butil oleato (D). Los valores de conversión obtenidos en la Tabla 3.3 pueden ser cotejados con la intensidad de las manchas observada en las cromatografías lo que concuerda sobre todo en A, B y C. En el caso de la síntesis de ter-butil oleato se pueden observar algunas manchas en los carriles 7, 9 y 15 que se encuentran a la misma altura que el estándar químico. En un trabajo similar, Abdul Rahman y cols. (2011) reportaron para CALB un perfil de velocidad inicial muy similar al encontrado en este trabajo (isobutanol>butanol>sec-butanol) empleando hexano como solvente y a temperaturas entre 55°C y 65°C. Además reportaron conversiones mayores al 96% para los mismos tres alcoholes y alcanzaron un 39.1% de conversión para la síntesis de ter-butil oleato [132].

Figura 3.13. Cromatografías de capa fina de la síntesis de diferentes ésteres del ácido oleico. En A se muestra la síntesis del n-butil oleato, en B isobutil oleato, en C sec-butil oleato y D ter-butil oleato. En 1 se muestra el testigo sin enzima, 2 es el estándar del éster correspondiente sintetizado químicamente, 3 es el bagazo de caña con oliva fermentado, 4 es el bagazo de caña con cascarilla de maíz fermentado, 5 es el extracto crudo inmovilizado¸ 6 es el inmovilizado del extracto crudo delipidado, 7 es la lipasa de Thermomyces lanuginosus, 8 es la lipasa de Pseudomonas cepacea, 9 y 10 son las lipasa B y A de Candida antarctica respectivamente. En el carril 11 se muestra la lipasa de Rhizomucor miehei, 12 es la lipasa de Carica papaya, 13 la lipasa de Aspergillus niger, 14 la lipasa pancreática porcina y 15 lipasa de Candida rugosa. La reacción se llevó a cabo en un volumen de 3 mL a 50°C con agitación magnética a 500RPM y una relación molar de 1:1.5 ácido: alcohol (la concentración inicial de ácido oleico fue de 100 mM).

3.3.3. Síntesis de dipropionato de luteína

Las xantofilas, como la luteína, son compuestos antioxidantes que se encuentran en muchos vegetales. A la luteína y a sus derivados se les han atribuido propiedades benéficas para el ser humano, como la protección de las células maculares en la retina y cierto efecto anti-tumoral. A nivel

66

molecular se trata de un compuesto de aproximadamente 40 átomos de carbono de largo con 1 grupo OH a cada extremo en posición secundaria. En este trabajo se decidió sintetizar el dipropionato de luteína (DPrL) empleando diferentes preparados enzimáticos propios y comerciales como biocatalizadores. En la Figura 3.14 se muestra una cromatografía de capa fina que muestra la conversión de la reacción de síntesis después de 20h. En el primer carril se muestra el estándar químico (STD), seguido del extracto inmovilizado de A. ochraceus (Aoc), la lipasa de Pseudomonas cepacea (PCL), Thermomyces lanuginosus (TLL), lipasas A y B de Candida antarctica (CALA y CALB), Carica papaya (CPL) y pancreática porcina (PPL). A partir de la intensidad de la mancha de aparición del producto (Rf=0.65), se observó que la reacción se llevó a cabo con AocL, PCL, CALA y CALB. Por otra parte, TLL lo hizo en menor proporción, mientras que CPL y PPL no llevaron a cabo la reacción en el tiempo ensayado. En la literatura no existen muchos reportes de la síntesis de derivados de xantofilas. Nakao y cols (2008) reportaron la síntesis de los ésteres de la astaxantina (otra xantofila) con ácido octanoico o trioctanoína alcanzando rendimientos del 36% empleando la lipasa de Candida cylindracea (Lipase OF®) inmovilizada en una resina de intercambio aniónica hidrofóbica [133]. En nuestro caso fue complicado determinar la conversión debido en parte a que la reacción se llevó a cabo en dos fases (sólida-líquida) dada la baja solubilidad de la luteína en hexano. Este comportamiento en síntesis de la actividad presente en A. ochraceus probablemente muestre otras características interesantes, por lo que en la sección 3.4 se decidió enfocar la atención en ella.

Figura 3.14. Cromatografía de capa fina que muestra la síntesis de DPrL y el testigo negativo con Lewatit CNP105® activado. Se utilizó hexano como solvente a 50°C y con agitación orbital.