Espectroscopía de fluorescencia resuelta en tiempo

Las mediciones de fluorescencia se pueden distinguir en dos tipos: fluorescencia en estado estacionario o estático, y mediciones de fluorescencia resuelta en tiempo. La fluorescencia en estado estacionario es aquella que se realiza con una iluminación constante. La muestra es iluminada con un haz continuo de luz, y se registra la intensidad o espectro de emisión. Dado que el proceso de absorción es mucho más rápido (k ≈10¹⁵ s^-1) que los procesos subsecuentes, radiativo o no radiativo (k ≈10¹⁰ – 10⁷ s^-1), la concentración de la especie permanece constante en estado excitado, bajo iluminación continua, lo que significa que se encuentra en un estado estacionario.

Por ello las medidas bajo estas condiciones se conocen como fluorescencia en estado estacionario.

Con esta técnica se observa simplemente un promedio del decaimiento de intensidad de fluorescencia que es proporcional al tiempo de vida de fluorescencia^1,2. En la Figura 4.9.1 se muestran ejemplos de los espectros obtenidos por cada tipo de técnica. En la primer fila se observan graficas de fluorescencia con un excitación continua, en ambos gráficos se presentan la intensidad de fluorescencia en función de onda y en la segunda se presenta el logaritmo de la intensidad de emisión en función del tiempo. En la segunda fila se presenta las graficas con pulsos, en la primer grafica se observa la constante de velocidad en función del tiempo, y en la segunda el logaritmo de la intensidad de emisión en función del tiempo, donde la línea vertical representa el pulso de excitación y la line con pendiente negativa representa el decaimiento de fluorescencia.

Figura 4.9.1 Espectros de fluorescencia resuelta en tiempo y estacionaria.

El otro tipo de mediciones de fluorescencia son las resueltas en tiempo, que se usan para medir decaimientos de intensidad o decaimiento de anisotropía (r). Para estas mediciones, la muestra es expuesta a un pulso de luz con una anchura que es típicamente más corta que el tiempo de decaimiento de la muestra. Este decaimiento de intensidad es registrado con un sistema de detección de alta velocidad que permite que la intensidad o anisotropía sean medidas en una escala de tiempo de nanosegundos a femtosegundos. Las mediciones resueltas en tiempo típicamente requieren instrumentos más complejos y caros, sin embargo, hay muchas razones para su uso.

Mucha información molecular disponible de la fluorescencia se pierde durante los procesos que promedian el tiempo. Por ejemplo, los decaimientos de anisotropía de proteínas fluorescentes o de moléculas orgánicas pequeñas fluorescentes son frecuentemente más complejos que una sola exponencial. El decaimiento de intensidad también contiene información que se pierde durante un proceso promediado. Frecuentemente, las macromoléculas existen en más de una conformación, y el tiempo de decaimiento de una sonda unida puede depender de la conformación. El decaimiento de intensidad puede revelar dos tiempos de decaimiento, y por tanto la presencia de más de una especie^1,2.

Existen dos tipos de estudios con fluorescencia de resolución temporal, la primera es para medir el decaimiento de la intensidad de fluorescencia después de un pulso de excitación, esta se utiliza para determinar el tiempo de vida de fluorescencia de un fluoróforo, que refleja el tiempo promedio en el estado excitado de cada molécula. La utilidad de las mediciones del tiempo de vida de fluorescencia surge del hecho de que muchos eventos dinámicos pueden desactivar el estado excitado y, por lo tanto, influir en la vida útil; estos eventos pueden ser la relajación por interacción con el disolvente, fluctuaciones en conformación macromoleculares, rotaciones, interacciones con

residuos vecinos y enfriamiento por agentes exógenos. El otro tipo de experimento de fluorescencia con resolución temporal implica la medición del decaimiento de la anisotropía y se usa para caracterizar movimientos moleculares. El decaimiento de la anisotropía controla la reorientación del dipolo durante el tiempo de vida del estado excitado y puede dar información sobre movimiento local de fluoróforos, movilidad segmentaria o rotación de una macromolécula completa, por lo tanto, las mediciones pueden proporcionar datos hidrodinámicos que describen la difusión rotacional de una sonda y se puede utilizar tiempo real para seguir las dinámicas de las biomoléculas en un medio.

Experimentos de este tipo pueden usarse para corroborar las predicciones de simulaciones de dinámica molecular.^2,39

A continuación, en las siguientes secciones se describe la preparación, caracterización y estudio de una familia de fluoróforos conocida como cromenilio cianinas (CCy), los cuales se diseñaron para tener localización en membrana mitocondrial y con posibles aplicaciones como sondas moleculares para la determinación de parámetros químicos o fisicoquímicos, según las modificaciones estructurales implementadas. El proyecto aborda las limitaciones mencionadas anteriormente con respecto a las interferencias y se proponen algunas formas para intentar cuantificar e identificar a las principales contribuciones que afectan la fluorescencia. Se seleccionó una sonda que fue sensible a la oxidación con oxígeno singlete y se implementó una metodología que involucró la caracterización con fluorescencia ultra-rápida, para elucidar los procesos fotofísicos que rigen a la molécula, y se logró compaginar con estudios in vivo utilizando al modelo pez cebra, aunado al modelado molecular computacional que ayudó a describir de mejor forma los cambios estructurales que presentó la sonda. Por lo que éste estudio se presenta como una opción metodológica para generar sondas fluorescentes de manera sencilla y una metodología de caracterización que va desde la fotofísica hasta la aplicación biológica.