VIII. Resultados y discusión
8.3. Estructura de las comunidades de microorganismos presentes en el sistema 59
En su totalidad, se obtuvo ADN de calidad de las muestras del sistema en serie. Como se mencionó en el apartado 7.6, no fue posible obtener ADN de calidad de ninguna
60 muestra de vinaza, ya que la concentración en promedio fue de 19.9 ± 3.73 ng μL-1 y la pureza (medida como la relación 260/280) fue de 1.72 ± 0.18. Asimismo, fue imposible confirmar la integridad de los extractos, por lo que no se procesaron. Debido a la contingencia sanitaria, no fue posible hasta el momento de escritura de esta tesis tener resultados de la secuenciación de las muestras B24-B26, C6 ni L24-L26. A pesar de esto, los principales resultados obtenidos a partir de las muestras biológicas se describen en los siguientes apartados. En el anexo Error! Reference source not found. se muestra un listado de todas las muestras y el día en el que fueron tomadas con el fin de facilitar la comparación con resultados previamente discutidos.
8.3.1. Composición de los microorganismos planctónicos en el AMBBR
En la Tabla 14, se señala la correspondencia de las muestras con la fase del experimento. Los extractos de ADN de este tipo de muestra en general mostraron resultados muy satisfactorios. La concentración promedio fue de 199.45 ± 127.83 ng μL-1 y la pureza de 1.86 ± 0.04. Se confirmó la integridad del ADN en todas las muestras. Se presentaron bandas íntegras de más de 10 kb en los electrogramas sin presencia de degradado (anexo C).
Tabla 14. Muestras de ADN extraídas del líquido del AMBBRy su correspondencia.
*No secuenciado aún.
Al procesar las secuencias in silico, más del 90% de estas solaparon correctamente mediante el script flash. Al desreplicarlas, se encontraron en promedio alrededor de
IDs de muestra Fase COV (g DQO L-1 d-1)
B1 B2 B3 B4 B5 B6 1 54.5
B7 B8 B9 B10 2 81.8
B11 B12 B13 B14 3 109.1
B15 B16 B17 B18 4 136.4
B19 B20 B21 B22 5 163.6
B23 B24* B25* B26* 6 157-174.6
61 60,000 secuencias únicas. En promedio, 35% de las secuencias fueron quiméricas.
Después de eliminar los singletons, se encontró que el 8.9% de estas correspondían a secuencias únicas. Finalmente, se trabajó con 1269 OTUs.
En la Figura 16, se observa la abundancia relativa de OTUs a nivel de filo en las fases.
Se destaca la prevalencia de Firmicutes en todo el proceso (59-91%). El filo Bacteroidota comienza a ser abundante a finales de la 2º fase, llegando hasta una abundancia de 32.94% a mitad de la 4a fase. Aun así, disminuye a 6.75% a inicios de la última fase. El tercer taxón con mayor abundancia es Proteobacteria. Su punto más alto ocurre a finales de la fase inicial (19.17%), pero disminuye casi de manera concomitante con la aparición de Bacteroidota a partir del final de la 2a fase.
Adicionalmente, hay presencia de otros taxones mucho menos abundantes (menos del 10%) tales como Actinobacteriota (prevalente en todo el proceso) o Chloroflexi.
Figura 16. Abundancias relativas de los OTUs presentes en el AMBBR a nivel de filo de manera planctónica. Se realizó un corte al 0.2%.
62 El punto máximo de producción de H2 fue a finales de la fase 2, relacionado con la gran abundancia de Firmicutes y la presencia, en menor cantidad, de Proteobacteria.
La presencia de Bacteroidota podría ser perjudicial para el sistema, ya que se ha reportado que este filo podría oxidar el H2 (Islam et al., 2020). Los miembros de este último filo podrían estar asociados a un aumento en la carga orgánica. Sin embargo, parecen no tolerar la máxima COV estudiada en el presente trabajo.
En comparación con las muestras del reactor en lote de la sección 8.1.3, hay semejanzas, tales como la gran abundancia de Firmicutes y la presencia de Proteobacteria en mayor o menor grado en todo el proceso fermentativo.
En la Figura 17 se observan a nivel de género los taxones más abundantes. Por un lado, Sporolactobacillus, miembro del filo Firmicutes, fue el género con mayor abundancia en todo el proceso (52-27%). Clostridium fue otro miembro del mismo filo con una prevalencia relativamente estable (28-15%) hasta la última fase. Estos dos taxones, en conjunto, fueron los más abundantes en todo el proceso como se mencionó en la descripción de la figura anterior. Sin embargo, a partir de la tercera fase y sobre todo en la última muestra analizada, la abundancia de Lactobacillus (otro miembro del mismo filo) se vuelve importante, ya que su valor relativo se dispara de 8.4 a 22.5% al aumentar la carga hasta vinaza sin diluir.
Por otro lado, Prevotella fue el miembro más abundante del filo Bacteroidota y es el género identificado que aparece a partir de la 3a fase pero que, para la última, disminuye su abundancia. Acetobacter forma parte del filo Proteobacteria y es el género identificado cuya abundancia relativa disminuye de manera concomitante con el aumento de Prevotella. Por último, hay presencia de otros OTU menos abundantes (menos del 10%) como, por ejemplo, Bifidobacterium (filo Actinobacteria), el cual aparece a partir del final de la 2a fase.
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Figura 17. Abundancias relativas de los OTUs presentes en el AMBBR a nivel de género de manera planctónica. Se realizó un corte al 3.0%.
En cuanto a la productividad de H2 obtenida en el AMBBR, se relacionan los géneros más abundantes Sporolactobacillus, Clostridium y, en menor medida, a la presencia de Bifidobacterium y Ethanoligenens. Sin embargo, la presencia de Prevotella a partir de ese punto pudo haber impactado la producción gaseosa. Por otro lado, ya que la composición del gas del AMBBR permaneció relativamente estable, se intuye que no afectó de manera significativa en la productividad. Existen reportes mixtos en la literatura acerca de Lactobacillus, ya que algunos son productores de H2 (Asada et al., 2006), mientras que algunos consumen el sustrato sin producción de gas y/o generan bacteriocinas (péptidos antagonistas de bacterias) (Noike, 2002) o peróxido (Hertzberger et al., 2014). Incertae (Incertae sedis) se trata de miembros del orden Clostridiales, los cuales también se han asociado a producción de H2 (Chiariotti et al., 2018)
64 8.3.2. Poblaciones presentes en las muestras de soportes para biopelícula del
AMBBR
En la Tabla 15 se señala la correspondencia de las muestras con la fase del experimento; también es importante recordar y destacar que se muestreó al final de cada fase.
Tabla 15. Muestras de ADN extraídas de los soportes de biopelícula del AMBBRy su correspondencia.
ID de muestra Fase COV (g DQO/L·d)
C1 1 54.5
C2 2 81.8
C3 3 109.1
C4 4 136.4
C5 5 163.6
C6* 6 157-174.6
*No secuenciado aún.
Todas las muestras de ADN extraídas de la biopelícula de los soportes pasaron los parámetros de calidad establecidos. La concentración promedio fue de 166.27 ± 97.46 ng μL-1 mientras que la relación 260/280 fue de 1.87 ± 0.03. En AGE, se observaron bandas íntegras de más de 10 kb en los electrogramas presentes en el anexo C.
Al procesar las secuencias, se encontró que en promedio más del 90% formaron contigs. Al desreplicarlas, se encontraron en promedio alrededor de 80,000 secuencias únicas. Se encontró que alrededor de 34% de las secuencias fueron quiméricas. Después de eliminar singletons, se encontró que el 84.75% de las agrupaciones sólo tenían un miembro. Finalmente, el número de OTUs con el que se trabajó fue de 513. Esto contrasta con el número de OTUs encontrados en el AMBBR de forma planctónica. La menor cantidad presente en los últimos es señal de menor riqueza ecológica. Sin embargo, ambos elementos están presentes en el mismo
65 reactor, por lo que, de encontrarse otros taxones, aumentarían la robustez del sistema (Wu et al., 2019).
En la Figura 18, se observa la abundancia de taxones presentes en las biopelículas a nivel de filo y su prevalencia en las fases. Al igual que en las muestras de sedimento del AMBBR, el taxón dominante es Firmicutes (42-76%), lo cual indica que muy posiblemente sea el filo con mejor adherencia a los soportes Kaldnes K1. El segundo más abundante es Bacteroidota, el cual incrementa su valor relativo de un promedio de 9% en las primeras dos fases a un promedio de 28% hasta la quinta fase. Este valor es comparable al obtenido en el sedimento del AMBBR, al menos a partir de la tercera fase. Actinobacteriota es el tercer más abundante, con valores entre 4-20%
(mayor que en las muestras tipo B), seguido por Proteobacteria, cuyo valor relativo en la composición poblacional se mantuvo relativamente estable (4.7-7.6%).
Figura 18. Abundancias relativas de los OTUs presentes en la biopelícula de los soportes dentro del AMBBR a nivel de filo. Se realizó un corte al 0.2%.
66 La ausencia de Archaea posiblemente se deba a que previamente se ha reportado que los soportes de polietileno permiten preferencialmente la adhesión de bacterias hidrolíticas y fermentativas, a comparación de soportes hechos de cerámica o poliuretano (Silva et al., 2006).
A continuación, en la Figura 19 se pueden observar, a nivel de género, los OTUs más abundantes en las muestras de soportes. Al igual que en los extractos analizados a partir del sedimento del AMBBR, Sporolactobacillus y Clostridium son de los miembros más abundantes del filo Firmicutes, 27% y 10% en promedio, respectivamente, ambos con ligeras fluctuaciones a través de las fases. En contraste, está presente Lactobacillus, parte del mismo filo, el cual se encuentra en mayor abundancia (12.5%
en promedio) a finales de la 1a y 3a fase, mientras que en el resto del experimento se encuentra en menor abundancia (1.9%). Asimismo, de manera similar que, en las muestras tipo B, Prevotella vuelve más abundante a partir de la 3º fase, llegando a su valor más alto en la 4º (8.4-33.4%) y es el miembro con mayor abundancia del filo Bacteroidetes. Su presencia en las biopelículas del reactor es más notoria, ya que en las muestras del sedimento del AMBBR, su abundancia relativa en las primeras 2 fases fue prácticamente despreciable, mientras que en los soportes su abundancia desde el final de la 1a fase fue de 10.7%. Del filo Actinobacteria, el miembro más abundante es Bifidobacterium y, de manera comparable con Prevotella, se encuentra con mayor abundancia en los soportes que de manera planctónica en el reactor, fluctuando su abundancia desde 2.9% en la 1ª fase hasta 18.7% en la 3ª, cuyo valor decae en las siguientes fases.
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Figura 19. Abundancias relativas de los OTUs presentes en la biopelícula de los soportes dentro del AMBBR a nivel de género. Se realizó un corte al 3.0%.
Ya que la mejor producción de H2 se obtuvo en la segunda fase, podría estar relacionada de manera positiva con los géneros Sporolactobacillus y Clostridium, así como posiblemente Bifidobacterium. Esto, ya que son los más abundantes en las muestras de biopelícula de los soportes del AMBBR y se ha demostrado que son beneficiosas para el proceso hidrogenogénico. Asimismo, podría relacionarse de manera negativa con el género Prevotella ya que comienza a ser más abundante a medida que disminuye la producción de gas y se ha reportado que puede competir por el sustrato, aunque también puede aglutinarse con otros microorganismos y ayudar en la formación de la biopelícula (Cabrol et al., 2017).
Es necesario, para un análisis más integral, secuenciar y analizar el resto de las muestras ya que no es correcto relacionar la peor producción de H2, obtenida en la 6a fase, con los resultados obtenidos aquí, aunque cabe destacar que C5 es básicamente
68 el precursor microbiano de la fase 6, por lo que muy posiblemente podría haber correlación de la producción de gas del AMBBR con las abundancias de esta última muestra.
8.3.3. Composición de los microorganismos que forman parte del LAG en el UASB
En la Tabla 16 se muestra la correspondencia de las muestras con la fase del experimento:
Tabla 16. Muestras de ADN extraídas del sedimento del UASBy su correspondencia. ID’s de muestra Fase
L1 L2 L3 L4 L5 L6 1 L7 L8 L9 L10 2 L11 L12 L13 L14 3 L15 L16 L17 L18 4 L19 L20 L21 L22 5 L23 L24* L25* L26* 6
*No secuenciado aún.
La extracción de ADN fue satisfactoria, ya que las muestras pasaron todos los estándares de calidad. La concentración fue en promedio de 65.69 ± 26.97 ng/μL mientras que la pureza (260/280) fue de 1.81 ± 0.07 ng μL-1. En cuanto a la integridad, se observaron bandas de tamaño de más de 10 kb en los electrogramas. Asimismo, la gran mayoría no presentaron degradado, mientras que el resto presentó degradado leve (anexo C). A pesar de esto, la secuenciación posterior fue exitosa.
Al procesar las secuencias, se encontró que en promedio más del 99% de estas solaparon correctamente. Al desreplicarlas, se encontraron en promedio alrededor de 60,000 secuencias. Se encontraron un promedio de alrededor de 45% secuencias quiméricas del total de secuencias únicas. Filtrando los singletons del resto de las
69 secuencias, se encontró que el 5.0% de estas correspondían a secuencias únicas.
Finalmente, el número de OTUs con el que se trabajó fue de 1232. La cantidad, semejante a la obtenida en 8.3.1 puede ser porque, al no contar con un sedimentador de biomasa, una gran cantidad de bacterias se transfirieron al segundo reactor, y formaron parte de los gránulos. Es decir, posiblemente gran parte de los OTUs presentes en el UASB provengan del AMBBR.
En la Figura 20, se distinguen los taxones más abundantes del UASB a nivel de filo.
El más abundante detectado fue Firmicutes (37-61%), seguido de Bacteroidota (19- 42%). El único taxón relativamente abundante perteneciente al dominio Archaea es Euryarchaeota. Desde la fase 1 su abundancia disminuyó drásticamente (de 28% a un promedio de 11.2%). Sin embargo, su descenso a un promedio de 2.52% se dio a partir de la mitad de la fase 3 (L13). Actinobacteria y Proteobacteria también prevalecieron en el proceso. La abundancia del primero aumentó a partir de la mitad de la fase 2 (L9), mientras que el segundo varió entre 1.98% y 6.93%.
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Figura 20. Abundancias relativas de los OTUs presentes en el sedimento del UASB a nivel de filo. Se realizó un corte al 0.2%.
Euryarchaeota representa mayoritariamente al dominio Archaea en las muestras, ya que su valor es más del 85% en todas. Se detectó presencia de Halobacterota (género identificado: Methanosaeta), Crenarchaeota (clase identificada: Nitrososphaeraceae) pero su abundancia fue despreciable (mucho menor que 0.3%).
En la Figura 21, se observan los géneros de microorganismos más abundantes. Se destacan las abundancias de Prevotella (19-42%), seguido de Sporolactobacillus (14- 29%), que corresponde a casi la mitad de la abundancia relativa total del sistema en todo el experimento. En menor grado, Clostridium (7.2-13.8%), Bifidobacterium (1- 15%) Methanobacterium (miembro de Euryarchaeota y el único cuya abundancia supera el 85% de los Archaea); el cual tiene abundancias prácticamente iguales que las de su filo o, en mucho menor grado, otros tales como Acetobacter, Lactobacillus o Caproiciproducens.
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Figura 21. Abundancias relativas de los OTUs presentes en el sedimento del UASB a nivel de género.
Se realizó un corte al 3.0%.
La abundancia relativa de Euryarchaeota (principalmente Methanobacterium) puede haber sido subestimada, probablemente debido a las copias del gen ADNr 16S a comparación de otros filos (Campanaro et al., 2018). Sin embargo, la baja producción de CH4 coincide con el decaimiento de su abundancia relativa. La presencia de bacterias ácido-lácticas como Bifidobacter, Lactobacillus o Sporolactobacillus pudo haber aportado al sistema ya que ha sido previamente relacionado con productividad de CH4 (Yun et al., 2016). Sin embargo, debido a la complejidad del sistema en serie, es difícil llegar a la misma conclusión, ya que en el UASB la hidrogenogénesis predominó sobre la metanogénesis a partir de la fase 3. Por otro lado, algunos autores relacionan la presencia de Clostridium y Caproiciproducens con acidificación del medio (Wang et al., 2020).