Inmovilización de la enzima sobre diatomitas calcinadas

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6.2.5.4. Estabilidad de los biocatalizadores. Se estudió la estabilidad de los biocatalizadores durante el almacenamiento seco a 4 °C. Para ello se evaluó la actividad de los biocatalizadores recién preparados y luego de un mes de almacenamiento empleando el ensayo típico de decoloración de OII (0.045 mM) en presencia de P (0.09 mM) en BF a pH9.

Se evaluó también la estabilidad del biocatalizador DSGE en medio húmedo. En este caso, DSGE fue almacenado a 4 °C durante un mes en un medio húmedo (40 mg DSGE en 5 mL de BF 100mM, pH 9). Pasado este tiempo se evaluó la actividad del DSGE utilizado el ensayo de decoloración de OII (0.045 mM) con P (0.09 mM).

Capítulo 6:

Inmovilización de la enzima peroxidasa sobre diatomitas naturales

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Figura 6.5. Diatomitas calcinadas (D), soporte para la inmovilización de la enzima HRP.

6.3.1.1. Tiempo de inmovilización. La Figura 6.6 muestra el cambio de la carga específica de enzima inmovilizada (Q, mgHRP/gD) en función del tiempo de inmovilización. Se observa que bajo las condiciones ensayadas los valores de Q alcanzaron un máximo de aproximadamente 8.4 mgHRP/gD entre las 15 y 24 h de contacto a temperatura ambiente.

De acuerdo a este resultado, por comodidad operativa todos los ensayos siguientes se realizaron empleando un tiempo de inmovilización de 24 h.

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Figura 6.6. Carga enzimática específica (Q) en función del tiempo de inmovilización.

Condiciones: 1g DSG, 20 °C, pH 7. Concentración de enzima en la mezcla de inmovilización: 1000 mg/L. Los valores de Q se expresan con su correspondiente desviación

estándar.

6.3.1.2. Concentración de enzima en la mezcla de inmovilización. De acuerdo a la literatura (Gomez y col., 2006; Bilal y col., 2018), así como lo comentado en el Capítulo 5, el aumento de concentración de HRP en la mezcla de inmovilización produce un incremento de Q y en consecuencia, una mayor actividad catalítica del material. Por tal motivo, se estudió la inmovilización de la enzima durante 24 h empleando diferentes concentraciones de enzima en la mezcla de inmovilización. La Figura 6.7 muestra que Q aumentó de forma aproximadamente lineal en función de la concentración de HRP en la inmovilización, alcanzando un máximo de 8.9 ± 0.4 mgHRP/gD.

A partir de los resultados obtenidos se decidió que los siguientes experimentos de inmovilización de HRP sobre diatomitas se llevarían a cabo por 24 h empleando 1000 mg/L de HRP en la mezcla de inmovilización. Cabe mencionar que para no incrementar demasiado

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Q (m g E /g D )

0 2 4 6 8 10

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los costos asociados al uso de enzima, la concentración de HRP en la mezcla de inmovilización nunca fue superior a 1000 mg/L.

Figura 6.7. Efecto de la concentración de enzima en la mezcla de inmovilización sobre los valores de Q. Condiciones de inmovilización: 1g DSG, 20 °C, pH 7 por 24 h. Los valores de

Q se expresan con su correspondiente desviación estándar.

6.3.1.3. Efecto de la hidrolisis superficial del soporte sobre la carga enzimática. Los grupos silanol (-SiOH) sobre la superficie de materiales a base de sílice son indispensables para la inmovilización de enzimas mediante unión covalente empleando APTES (Caliskan y col., 2011; Zucca y Sanjust, 2014; Zdarta y col., 2018). Aunque el proceso de calcinación de las diatomitas incrementa su resistencia mecánica, también favorece la formación de grupos siloxano (-Si-O-Si-) en la superficie de las diatomitas, reduciendo el número de sitios de unión del APTES. La literatura indica que este problema puede revertirse, al menos en parte, mediante un pretratamiento ácido el cual favorece la ruptura de los puentes siloxano, restableciendo los grupos -SiOH superficiales (X.-J. Huang y col., 2008; Inchaurrondo y

Concentración HRP (mg/L)

0 200 400 600 800 1000 1200

Q ( m g HR P/g D)

0 2 4 6 8 10

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col., 2016; Cabrera y col., 2017; Inchaurrondo y col., 2017). Por lo tanto, durante la síntesis de los biocatalizadores se introdujo un paso de hidrólisis ácida de las diatomitas calcinadas (D) con el objetivo de incrementar los grupos silanol y de este modo incrementar Q.

En la Figura 6.8 se comparan los resultados obtenidos de carga enzimática de los biocatalizadores a base de diatomitas calcinadas con la enzima unida covalentemente (DSGE) y con el paso intermedio de hidrólisis (DHSGE). A efectos comparativos, también se muestra la carga enzimática correspondiente a los biocatalizadores obtenidos por adsorción de la HRP sobre diatomitas calcinadas (DE). Cuando la HRP se inmovilizó por unión covalente sobre las diatomitas calcinadas (DSGE), los valores de Q fueron prácticamente el doble con relación a la inmovilización por adsorción (DE). Esto era de esperarse, ya que mediante la funcionalización y activación de los soportes se puede incrementar el contenido de proteína inmovilizada (Shaw y col., 2006; Cabrera y col., 2017).

Sin embargo, la carga de enzima inmovilizada sobre diatomitas pretratadas con ácido nítrico (DHSGE) fue menor a DSGE y prácticamente similar a la obtenida por adsorción (DE).

Según varios autores, ésto podría deberse a que los soportes muy reactivos provocan un injerto masivo del APTES, lo que conlleva la acumulación excesiva de grupos funcionales inestables, afectando la activación del material y posterior inmovilización de las enzimas.

Otra posibilidad es que el ácido nítrico haya provocado un bloqueo de los sitios de unión, por nitración ácida de los grupos silanol (Zucca y Sanjust, 2014; Zdarta y col., 2018).

Capítulo 6:

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Figura 6.8. Carga enzimática (Q) correspondiente a los biocatalizadores obtenidos mediante diferentes técnicas de inmovilización: adsorción (DE), inmovilización covalente (DSGE),

inmovilización covalente con pretratamiento ácido (DHSGE). Condiciones de inmovilización: concentración de enzima = 1000 mg/L, 20 °C, pH 7, 24 h. Los valores de Q

se expresan con su correspondiente desviación estándar.