En cèl·lules de tiroide

165

RESULTATS

166

RESULTATS

Amb això, vam decidir estudiar dues línies cel·lulars humanes de tiroides diferents, com és la línia FTC-133, derivada d’un carcinoma fol·licular de tiroide i que presenta pèrdua de Pten, i la línia CAL-62, derivada d’un carcinoma de tiroide anaplàstic.

Primerament vam plantar les dues línies en condicions 2D i al cap de 24h les vam tractar amb Metformina i vam realitzar un assaig d’incorporació BrdU durant 3h. El que vam observar és que mentre que la línia FTC-133 era sensible a la Metformina i mostrava una reducció en la proliferació, CAL-62 no ho feia (Fig. 26).

La Metformina regula les vies de senyalització TGF-β/Smads, MAPK/ERK i PI3K/AKT en les línies cel·lulars humanes de tiroides FTC-133 i CAL-62

Vam decidir doncs analitzar les targets principals d’actuació de la Metformina mitjançant assajos Western Blot i mirar els nivells de proteïna de les diferents vies d’interès. Vam veure una regulació a la baixa de molècules de les vies PI3K/AKT, MAPK/ERK, TGF- β/SMADs, així com augment de p-AMPKα en ambdues línies (Fig. 27). A més a més, vam observar la pèrdua de PTEN en FTC-133 en línia amb un augment en pAKT.

Figura 26. El tractament amb Metformina redueix la proliferació de la línia cel·lular humana de tiroide FTC-133 però no de CAL-62. Immunofluorescència de BrdU i quantificació de cultiu 2D de línies humanes de tiroides FTC-133 i CAL-62 no tractades (Control) i tractades amb Metformina 20 nM durant 48 h. Els cultius van ser contratenyits amb Hoechst per visualitzar el nucli. Escala:

100 µM. Els valors són mitjanes i les barres d'error representen la mitjana ± S.E.M. *P<0,05 per one-way ANOVA, seguit pel test de comparació múltiple Tukey. NS: no significatiu.

0 20 40 60 80

NS

*

CAL-162 FTC-133

CONTROL METF

Cèl·lules BrdU positives (%)

167

RESULTATS

El TGF-β desencadena un fenotip d’EMT en cultius tridimensionals de CAL-62 i aquest procés és inhibit per la Metformina

De nou, vam voler relacionar la Metformina amb els efectes del TGF-β. Així que vam cultivar FTC-133 i CAL-62 en condicions 3D i les vam tractar i co-tractar amb Metformina 20 nM i 10 ng/ml del TGF-β durant 48h. Tant FTC-133 com CAL-62 expressen Vimentina (Jeon et al., 2016). No obstant això, el que vam descobrir és que les cèl·lules CAL-62 amb el tractament del TGF-β patien un procés d’EMT ja que canviaven el fenotip de les cèl·lules arrodonies a un fenotip de cèl·lula més allargada i espiculada. Això va ser revertit per la Metformina (Fig. 28), resultats en concordança amb les cèl·lules epitelials endometrials wt descrites anteriorment (Fig. 19).

Figura 27. La Metformina regula les vies de senyalització TGF-β/Smads, MAPK/ERK i PI3K/AKT en les línies humanes de tiroides estudiades. Western Blot de línies humanes de tiroides FTC-133 i CAL-62 en 2D sense o amb Metformina 20 nM (- o +) durant 3 h que mostra l’estat de les vies.

168

RESULTATS

Figura 28. TGF-β desencadena la Transició Epiteli-Mesènquima en cultius 3D de CAL-62 i això és inhibit per la Metformina. Imatges de microscopi de contrast de fases i immunofluorescència de Vimentina de cultiu 3D de CAL-62 no tractat (Control), tractat amb Metformina 20 nM, 10 ng/ml del TGF-β o ambdòs durant 48 h. Els cultius van ser contratenyits amb Fal·loidina per visualitzar el citoesquelet i amb Hoechst per visualitzar el nucli. Escala: 100 µM.

169

RESULTATS

El TGF-β no desencadena l’EMT en cultius tridimensionals de FTC-133

El tractament amb el TGF-β dels cultius tridimensionals de FTC-133 no va desencadenar un fenotip EMT (Fig. 29).

La Transició Epiteli-Mesènquima desencadenada pel TGF-β en cultius 3D de CAL- 62 és mediada per pERK

Com que anteriorment ja havíem descrit que el procés d’EMT provocat pel TGF-β en cèl·lules epitelials d’endometri 2D era mediat per pERK, vam voler saber si en els cultius Figura 29. TGF-β no desencadena la Transició Epiteli-Mesènquima en cultius 3D de FTC- 133. Immunofluorescència de Vimentina de cultiu 3D de FTC-133 no tractat (Control), tractat amb Metformina 20 nM, TGF-β 10 ng/ml o ambdòs durant 48 h. Els cultius van ser contratenyits amb Fal·loidina per visualitzar el citoesquelet i amb Hoechst per visualitzar el nucli. Escala: 100 µM.

170

RESULTATS

CAL-62, l’EMT d’igualment era mediada per ERK. Vam cultivar CAL-62 en les mateixes condicions que abans, però aquest cop les vam tractar i co-tractar amb U0126 10 µM enlloc de Metformina, i amb el TGF-β. El que vam obtenir, va ser concloent: es produïa inhibició d’EMT quan s’inhibia la fosforilació d’ERK (Fig. 30).

Figura 30. La Transició Epiteli-Mesènquima desencadenada pel TGF-β en cultius 3D de CAL- 62 és inhibida per U0126. Immunofluorescència de Vimentina de cultiu 3D de CAL-62 no tractat (Control), tractat amb Metformina 20 nM, 10 ng/ml del TGF-β o ambdòs durant 48 h. Els cultius van ser contratenyits amb Fal·loidina per visualitzar el citoesquelet i amb Hoechst per visualitzar el nucli. Escala: 100 µM

171

RESULTATS

Els organides 3D de tiroide de ratolí deficients en Pten tenen un perímetre glandular major que els wt

Seguidament, vam voler estudiar la Metformina amb organoides derivats de tiroide de ratolí, així que vam dissenyar i optimitzar un nou cultiu per generar organoides de tiroide.

Vam utilitzar el model animal de ratolí CRE^+/- PTEN^F/F amb la injecció prèvia de l’animal de Corn Oil o TAM. Després de 4 setmanes, vam extreure les tiroides, les vam trossejar, digerir amb un medi de digestió, filtrar i plantar en condicions 2D + 2% matrigel al medi específic de tiroide amb suplement de Hormona Estimulant de la Tiroide o Thyroid- stimulating hormone (TSH). Al cap de 48 h, les vam plantar en condicions 3D, amb un llit base de matrigel i 3% de matrigel al medi. Aquests cultius aguantaven estables fins 5-6 dies sense cap canvi de medi.

Primerament vam corroborar la deleció de PTEN en aquest cultiu a través de Western Blot (Fig. 31A) i el primer que vam observar va ser que els dos genotips de cèl·lules (wt i PTEN KO) creixien formant glàndules de mides similars (Fig. 31B). Llavors vam pensar que la TSH estimulava tant la proliferació que potser no deixava veure canvis de creixement:

Així doncs, vam plantar els organoides amb TSH per al seu creixement òptim, i vam retirar del medi la TSH durant tres dies. Vam observar llavors que les cèl·lules deficients en Pten creixien formant organoides amb un perímetre glandular major que les wt (Fig.

32).

Figura 31. Els organoides de tiroides de ratolí tant wt com deficients en Pten tenen perímetres glandulars comparables en medi amb TSH. A. Anàlisi de Western Blot que mostra l’estat de PTEN en ambdós cultius. B. Imatges de microscopi de contrast de fases i quantificació d’organoides wt i PTEN KO de tiroides de ratolí amb mides de les glàndules sense diferències significatives. Escala: 100 µM.

A B

172

RESULTATS

El tractament amb Metformina activa l’apoptosi cel·lular en organoides 3D de tiroide de ratolí wt però no PTEN KO

D’igual manera que en els procediments anteriors, en aquest punt ens vam plantejar caracteritzar la resposta de la Metformina en relació al TGF-β. Així que vam cultivar els organoides wt, PTEN KO, i vam tractar i co-tractar els organoides amb Metformina 20 nM i 20 ng/ml del TGF-β. El que vam observar va ser que, per una banda, el TGF-β no va produir cap alteració en el fenotip de cap dels dos grups d’organoides (Fig. 33A). Per altra banda, la Metformina va activar caspasa-3 els cultius wt, indicadora de l’inici d’un procés d’apoptosi, però els cultius PTEN KO van ser resistents a aquesta apoptosi (Fig. 33A, B).

WT PTEN KO

0 100 200 300 400 500 600

***

Perímetre glandular (µm)

Figura 32. Els organoides de tiroides de ratolí deficients en Pten tenen perímetres glandulars superiors als wt en medi sense TSH. Imatges de microscopi de contrast de fases i quantificació del perímetre glandular d’organoides wt i PTEN KO de tiroides de ratolí que mostren les diferències de mides de les glàndules. Escala: 100 µM. Les barres d'error representen la mitjana ± S.E.M. ***P<0,001 per student’s t test.

173

RESULTATS

B A

Figura 33. La Metformina activa l’apoptosi cel·lular en organoides de tiroides de ratolí wt però no PTEN KO. A. Imatges de microscopi de contrast de fases de nuclis apoptòtics d’organoides wt i PTEN KO de tiroides de ratolí sense tractar (Control), tractats amb Metformina 20 nM i/o 20 ng/ml del TGF-β durant 48h. B. Immunofluorescència i quantificació de cleaved- casp3 dels organoides tractats o no amb Metformina durant 48h. Els cultius van ser contratenyits amb Fal·loidina per visualitzar el citoesquelet i amb Hoechst per visualitzar el nucli i el fenotip apoptòtic. Escala: 100 µM. Els valors són mitjanes i les barres d'error representen la mitjana ± S.E.M. ***P<0,001 per one-way ANOVA, seguit pel test de comparació múltiple Tukey. NS: no significatiu.

174

RESULTATS

2.2. Estudi in vivo de la Metformina en tumors d’endometri, tiroide i pròstata