3.1.1. Toma de las muestras para los análisis
Para la preparación de las muestras compuestas, se combinarán varias muestras simples y se tomarán en varios puntos del floculador. Éstas se recolectarán en recipientes de cuatro litros y se aplicará el protocolo para la preservación ellas, las cuales se transportarán y se preservarán en una hielera con abundante hielo hasta el momento de realizar los análisis.
3.1.2. Preparación de las muestras para análisis de microalgas y cianobacterias filamentosas
Para el tratamiento de la muestra, ésta se colocará previamente en una centrífuga en seis tubos de 50 mL cada uno, añadiendo 40 mL de muestra a cada tubo y se centrifugarán durante 15 minutos a 9 000 rpm con el objetivo de separar los componentes sólidos de la muestra. A partir de la centrifugación, se logrará la separación de la muestra en líquido clarificado y residuo sólido que se encontrará en el fondo de los tubos. El residuo sólido centrifugado se utilizará en el estudio, debido a que es donde se encuentran concentradas las microalgas y cianobacterias filamentosas.
La preparación de la muestra se realizará en 10 erlenmeyers de 250 mL, adicionando a cada uno, 25 mL del medio de cultivo BG-11 para proveer nutrientes a las algas. A cada erlenmeyer con medio de cultivo, se le añadirán 2 mL de muestra sólida centrifugada.
Para finalizar, a cada erlenmeyer, se le adicionará, según corresponda, la cantidad de producto químico por estudiar para el control de las microalgas y de las cianobacterias filamentosas, como se detalla en el punto 5.3., para así obtener las concentraciones
133 diferentes que se probarán en el tratamiento. Las muestras se analizarán durante tres días y se mantendrán en un agitador con luz por 72 horas.
3.1.3. Preparación del medio de cultivo
La habilidad exhibida por los microorganismos en el ambiente depende, tanto de las condiciones físicas, como de la distribución de los diferentes nutrientes. Por lo anterior, para el aislamiento y cultivo de las microalgas, es necesario tener en cuenta las necesidades alimenticias de cada una de ellas con el fin de brindarles los requerimientos necesarios para su supervivencia.
Los medios de cultivos generalmente se componen a partir de tres constituyentes:
macronutrientes, micronutrientes y vitaminas. Todos ellos se preparan como disoluciones madre, las cuales se mantienen en botellas en refrigeración a 4oC (las disoluciones de fosfatos no se deben almacenar en botellas de polietileno debido a la absorción de este elemento que puede ocurrir en el plástico).
3.1.4. Disoluciones madre
La cantidad de disolución madre por preparar dependerá de la cantidad de medios de cultivo requeridos para realizar el estudio en el laboratorio, pues, generalmente, se prepararán de 250 mL a 500 mL. Para la preparación de estas disoluciones, se deberán tener los cuidados necesarios, tales como limpieza del área de trabajo, además de tener a mano el procedimiento del medio y mucho orden. En caso de que el ambiente tenga mucho polvo, se pueden cubrir los instrumentos con un trapo limpio para evitar la introducción de partículas externas.
134 Las disoluciones madres deberán prepararse en forma analítica, para lo cual se utilizarán balones aforados, cuyo tamaño variará de acuerdo con la cantidad por preparar.
A continuación, se detallan los pasos:
1. Se deberán colocar, en el orden respectivo, todos los reactivos químicos necesarios para elaborar las disoluciones madre.
2. Se deberá calcular la cantidad por pesar para cada disolución madre de acuerdo con el volumen que se preparará.
3. En un beaker de tamaño adecuado, deberá colocarse la mitad del agua destilada necesaria para obtener el volumen final. El beaker se colocará en un agitador magnético y se le introducirá la pastilla magnética de agitación.
4. Se deberán pesar las cantidades exactas de componente de la disolución madre, según el cálculo realizado en el punto 2. Estas cantidades se agregarán al beaker y el contenido se sacudirá mediante el agitador magnético hasta obtener la disolución completa.
5. Una vez preparada la disolución, el contenido del beaker se trasvasará cuantitativamente a un balón aforado, mezclándolo bien y luego éste se aforará con agua destilada.
6. Una vez aforada, la disolución madre se mezclará bien y se colocará en un frasco limpio y etiquetado para su almacenamiento en refrigeración.
7. En el caso de los micronutrientes, son varios los reactivos que se deben utilizar, por lo tanto, se deberá tener cuidado a la hora de adicionarlos e ir agregando cada uno en forma ordenada, tal y como aparecen en las indicaciones (ver tabla 5).
135 3.1.5. Elaboración del medio de cultivo
Para la elaboración del medio de cultivo, también se deberán de tener los mismos cuidados indicados anteriormente. La preparación puede hacerse en un beaker, erlenmeyer u otro recipiente limpio, cuyo tamaño dependerá del volumen a preparar.
1. Colocar en la mesa de trabajo, las disoluciones madre correspondientes de acuerdo con el tipo de medio por preparar. Para cada disolución, se debe disponer de una probeta o pipeta para medir la cantidad por agregar. En caso de que se requiera una pipeta, no se debe pipetear lo que se necesite directamente de la disolución madre. En un beaker pequeño, deberá añadirse disolución madre y pipetear la alícuota necesaria desde él. El sobrante de disolución madre en el beaker se desechará en la pileta del laboratorio.
2. En el recipiente seleccionado para preparar el medio de cultivo, se colocará la mitad del agua destilada por utilizar (medida con probeta). Al recipiente con agua, se le añadirá una pastilla magnética y se colocará en un agitador magnético.
3. En la mesa de trabajo, en orden, se colocarán los frascos de las disoluciones madre por utilizar y, al lado de cada una, se colocan los instrumentos necesarios (beaker, pipeta o probeta) para medir la cantidad.
4. Agregar la cantidad de cada disolución madre una a una, permitiendo que cada una se disuelva completamente en el agua en agitación. Cuando se termine de agregar todas las disoluciones madre, se debe agregar la cantidad necesaria de agua destilada para llegar al volumen planificado.
5. Ajustar el pH del medio usando NaOH 1N o HCl 1N.
136 Tabla 5. Concentraciones de los macronutrientes utilizados para la disolución BG-11
BG-11 Medium, Modified
(Allen 1968, Allen &Stanier 1968, Rippka, et al. 1979) Componente Disolución madre
(g L-1 H2Od)
Concentración en el medio (M)
Cantidad usada/L Macronutrientes
1. NaNO3 150.0 g 1.76 x 10-5 10mL
2. K2HPO4.3H20 4.0 g 1.75 x 10-4 10mL
3. MgSO4.7H2O 7.5 g 3.04 x 10-4 10mL
4. CaCl2.2H2O 3.6 g 2.45 x 10-4 10mL
5. Ácido Cítrico 0.6 g 3.12 x 10-5 10mL
6. Citrato Férrico de Amonio
0.6 g(autoclave para disolver) 10mL
7. EDTA 0.1 g 2.79 x 10-6 10mL
8. Na2CO3 2.0 g 1.89 x 10-4 10mL
9. Metales traza H3BO3
MnCl2.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O Co (NO3)2.6H2O
2.86g 1.81g 0.222g
0.39 g 0.079 g 0.0494 g
4.63 x 10-5 9.15 x 10-6 7.65 x x10-7
1.61 x 10-6 3.16 x 10-7 1.70 x 10-7
1mL
Fuente: Elaboración propia de la investigadora para efectos del presente trabajo investigativo, 2021
Notas: Ajuste el pH a 7.4 con NaOH 1M o HCI.
137 Autoclave a 121 C por 15 minutos a 103 kPa man (15 psig)
Para medio sólido agregue 15 g de agar-agar por litro de medio nutritivo.
Agregar cada componente a aproximadamente ~ 800mL de agua destilada hasta disolver completamente, ajuste el volumen a 1 L.
3.2. Determinación de abundancia de microalgas y cianobacterias filamentosas