III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.4. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Las muestras inicial, extruida y sometidas a autoclave de la semilla de palta fueron tamizadas, para que de esa manera se trabaje con tamaño de partícula de 0,250 mm para todas las muestras.
Preparación de las muestras de semilla de palta 3.4.1.
Posteriormente a la recolección de las paltas se dejó madurar en unas cajas de cartón cubiertas interiormente con papel craft durante 5 días a temperatura ambiente, se procedió a comprobar la madurez organoléptica de los frutos con un penetrómetro para frutas.
Se tomó el penetrómetro entre el pulgar y el índice de la mano derecha, se aprieto el botón para puesta a punto del instrumento, se situó la punta sobre el fruto y se apretó progresivamente hasta hacer penetrar en la pulpa del fruto. Para cuando alcanzo el corte visible en el puntal (El puntal tiene que entrar en la pulpa progresivamente y no de golpe, si no la medición no será correcta), para evitar posibles errores de medición y controlar mejor la penetración del puntal, se apoyó la mano izquierda con el fruto a la pared, entonces con el brazo derecho rígido, se apretó el penetrómetro sobre la palta. La lectura correcta fue el valor promedio de las medidas.
Una vez maduras las paltas fueron cortadas por la mitad y las semillas fueron extraídas manualmente, obteniéndose además la pulpa y la cáscara, las semillas se lavaron con agua a 100-150 ppm de hipoclorito de sodio en un tiempo de inmersión de 2 a 3 min y se colocaron sobre la mesa para que se oree durante 5 min, estas semillas se colocaron en bandejas con papel craft para luego ser sometidos a deshidratación.
Figura 14. Procedimiento esquematizado de la preparación de las muestras
Se extrajo las semillas
Se lavaron a 100 ppm de hipoclorito de sodio, durante 2 a 3 min.
Maduración de las Paltas por 5 días a temperatura ambiente
Obtención de la muestra de semilla de palta inicial 3.4.2.
Una vez obtenido las semillas oreadas se procedió a secarlas en una estufa a una temperatura de 30°C por 100 horas.
Cuando las semillas estuvieron secas se separó el tegumento la cual se separa fácilmente cuando está seca para luego realizar una molienda gruesa para después pasarlo al molino de martillo.
Obteniéndose así la muestra inicial en polvo de la semilla de palta.
Figura 15. Procedimiento esquematizado de la obtención de la muestra de semilla de palta inicial
Obtención de la semilla de palta extruida 3.4.3.
Una vez obtenido las semillas oreadas se procedió a secarlas en una estufa a una temperatura de 30°C por 100 horas.
Cuando las semillas estuvieron secas se separó el tegumento la cual se separa fácilmente cuando está seca.
Se tamizo la muestra
Se deshidrato las semillas a 30°C por 100 horas
Se realizó la molienda en el molino de martillo
Luego se realizó el proceso de extrusión a una temperatura de 90°C y 120°C, el producto se enfrió y se dejó secar por un tiempo hasta que esté listo para después pasarlo por un molino de martillo y obtener la muestra extruida en polvo de la semilla de palta.
Figura 16. Procedimiento esquematizado de la obtención de la muestra de semilla de palta extruida.
Obtención de la semilla de palta sometida en el autoclave 3.4.4.
Una vez obtenido las semillas oreadas se sometieron en el autoclave a 80°C, 90°C y 120°C (esterilización) por 5 min, 10 min y 15 min.
Luego fueron secadas en una estufa a una temperatura de 30°C por 100 horas y el tegumento fue separado.
Cuando las semillas estuvieron secas, se procedió a moler con el molino y se obtuvo la muestra esterilizada (120°C) en polvo de la semilla de palta.
Se deshidrato a 30°C por 100 horas
Se realizó el proceso de extrusión, se dejó enfriar Se realizó la molienda en el
molino de martillo y luego se tamizo
Figura 17. Procedimiento esquematizado de la obtención de la muestra sometida en el autoclave.
Análisis Químico Proximal de las muestras de semilla de palta 3.4.5.
(Persea americana)
La determinación de los componentes se realizó en base a las normas AOAC 2000 (Métodos oficiales de análisis, Asociación de Químicos Analíticos Oficiales). En las cuales se mencionan los procedimientos a seguir según el componente a ser determinado.
a) Determinación de humedad : Método de la AOAC (2000)
Se determinó a través de la pérdida de peso que sufre la muestra por calentamiento, hasta obtener peso constante y se calculó el % de humedad por diferencia de peso
b) Determinación de Grasa total : Método de la AOAC (2000) Se realizó empleando el método Soxhlet
Se hizo la molienda para luego tamizarlo Se sometieron en el
autoclave
Se deshidrato las semillas a 30°C por 100 horas
c) Determinación de proteínas totales : Método de la AOAC (2000) Se evaluó a través del método Micro Kjeldahl, considerando 6,25 como factor de conversión del nitrógeno a proteína
d) Determinación de Cenizas : Método de la AOAC (2000)
Por incineración de la muestra a 600°C para quemar todo el material orgánico
e) Determinación de fibra cruda : Método de la AOAC (2000)
Se determinó eliminando los carbohidratos solubles por hidrolisis a compuestos más simples (azucares) mediante la acción de los ácidos y álcalis débiles en caliente y las cenizas (por diferencia de peso después de la ignición de la materia fibrosa obtenida)
f) Determinación de Carbohidratos : Método de la AOAC (2000) Se determinó por la diferencia del total 100% y el contenido de los demás ya mencionados arriba en porcentaje
Diseño experimental 3.4.6.
T2
T0 T3 T4 T5
SEMILLA DE PALTA
EXTRUIDO
Ɵ0, Ɵ1, Ɵ2, Ɵ3
-
AUTOCLAVADO
T1
Dónde:
T0: Temperatura inicial a 0°C
T1: Tratamiento por extrusión a 90°C por 2 minutos T2: Tratamiento por extrusión a 120°C por 2 minutos T3: Tratamiento a 80°C
T4: Tratamiento a 90°C T5: Tratamiento a 120°C Ɵ0: Tiempo inicial a 0 min Ɵ1: Tiempo de 5 min Ɵ2: Tiempo de 10 min Ɵ3: Tiempo de 15 min
Análisis estadístico 3.4.7.
a. Proceso de extrusión
Se evaluó el efecto de la temperatura de extrusión con 3 niveles sobre la reducción de taninos totales, se obtuvo para este fin 3 tratamientos en los cuales se aplicó un diseño completamente al Azar (DCA) con 3 repeticiones para cada tratamiento; obteniéndose como resultado un total de 9 unidades experimentales, las cuales se trabajó con un nivel de significancia del 95%( p≤0.05).
b. Proceso de Autoclavado
Se evaluó el efecto de la temperatura de Autoclavado con 3 niveles y el tiempo de esterilización con 4 niveles sobre la reducción de taninos totales, se obtuvo para este fin 12 tratamientos en los cuales se aplicó un diseño completamente al Azar (DCA) con arreglo factorial con 2 repeticiones para cada tratamiento; obteniéndose como resultado un total de 24 unidades experimentales, las cuales se trabajó con un nivel de significancia del 95%( p≤0.05).
Método de cuantificación de taninos totales 3.4.8.
Para realizar la cuantificación de taninos totales en las muestras (Autoclavadas, extruida y inicial) de la semilla de palta, se utilizó el método según Lastra et al., (2000) modificado para esto primero se realizó una extracción hidroalcohólica. El método consta de dos etapas: la etapa A donde se cuantifican los polifenoles totales en el extracto hidroalcohólico, y la etapa B donde se cuantificaron los polifenoles residuales después del secuestro de los taninos con gelatina; la cuantificación de cada una de las muestras se realizó por triplicado. Luego los resultados de las cuantificaciones de la etapa A y la etapa B se restaron y se obtuvo los taninos totales de la muestra.
a) Preparación del extracto hidroalcohólico
El extracto fue preparado con 1g de muestra en 10 ml de la solución de etanol y agua desionizada pasteurizada (50/50) y se mantuvo en constante agitación cada 15 min durante 12 horas a temperatura ambiente 15°C a 18°C. Una vez que cumplió el tiempo se filtró y se obtuvo el sobrenadante, luego se procedió a centrifugar el sobrenadante a 5000 rpm por 20 min.
Figura 18. Procedimiento esquematizado de la preparación del extracto hidroalcohólico.
Se agitó cada 15 min durante 12 horas a Temperatura ambiente
Se colocó 1g de muestra en 10 ml de solución de etanol al 50%
Se filtró y se obtuvo el sobrenadante
Luego se procedió a centrifugar el sobrenadante a 5000 rpm por 20 min
BLANCO A MUESTRA Se tomó 2400 uL de
agua desionizada y se agregó al tubo
Se agregó 100 uL del extracto hidroalcohólico de la muestra y se diluyo a 10 ml
De esto se tomó 2400 uL
Se agregó 6400 uL de agua desionizada, se homogenizo reposo 2 min y se procedió a la lectura a 700 nm.
Se agregó 800 uL de Folin, se agito y se dejó reposar por 5 min, Luego se añadió 400 uL de Na2CO3 se volvió agitar
b) Polifenoles totales ( A)
Se midieron exactamente 100 uL del extracto hidroalcohólico de la muestra y fueron transferidos a un tubo de ensayo, se diluyo con agua destilada para que complete a 10 mL, de este mismo se tomó 2400 uL y se agregó a un tubo de ensayo.
Para la preparación del blanco (A) se añaden 2400 uL de agua destilada en un tubo de ensayo.
Figura 19. Procedimiento esquematizado para cuantificar taninos totales (A).
c) Polifenoles residuales (B)
Se midieron exactamente 100 uL del extracto hidroalcohólico de la muestra y fueron transferidos a un tubo de ensayo con tapa y se completó a 10 mL con agua destilada.
De la solución anterior se tomó 1.5 mL y se colocó en un tubo, luego se adiciono 4.5 mL de agua, 3.75 mL de gelatina al 4%, 7.5 ml de NaCl saturado y acidificado y 0.75 g de caolín.
Se tapó, se agito durante una hora cada 15 min y se dejó en reposo durante 12 horas para posteriormente ser filtrado.
Luego se tomó 750 uL y fue transferido a un tubo para posteriormente adicionarle 3 mL de agua destilada, de este tubo se tomó 2400 uL y se agregó a otro tubo de ensayo.
Para la preparación del blanco (B) se tomó 6 mL de agua destilada y se colocó en un tubo, luego se adiciono 4.5 mL de agua, 3.75 mL de gelatina al 4%, 7.5 mL de NaCl saturado y acidificado y 0.75 g de caolín. Se tapó, se agito durante una hora y se dejó en reposo durante 12 horas para posteriormente ser filtrado. Luego se tomó 750 uL y fue transferido a un tubo para posteriormente adicionarle 3 ml de agua destilada, de este tubo se tomó 2400 uL y se agregó a otro tubo de ensayo.
d) Desarrollo de color
Para realizar la lectura en el espectrofotómetro a cada tubo de ensayo con las respectivas muestras de los polifenoles totales A, los polifenoles polifenoles residuales B y blancos.
Se le añadieron 800 uL de Folin, se agitó con un agitador de tubos y se dejó reposar por 5 min.
Luego se añadió 400 uL de Na2CO3, se volvió a agitar, se agregó 6400 uL de agua destilada y se homogenizó.
Se mantuvo en reposo 2 min y luego se realizó la lectura de las absorbancias de dichas soluciones en el espectrofotómetro a 700 nm.
Figura 20. Procedimiento esquematizado para cuantificar taninos totales (B).
Se agregó 100 uL del extracto hidroalcohólico de la muestra y se diluyo a 10 ml
BLANCO B MUESTRA
De esto se tomó 2400 uL y se agregó al tubo Se agregó 6ml de agua desionizada
De esto se tomó 1.5 ml
Se tapó, Se agito 1 hora cada 15 min luego reposo 12 horas Se filtró y se tomó 750 uL, se agregó 3 ml de agua.
Se adicionó 4.5ml, 3.75 ml de gelatina al 4%, 7.5 ml de NaCl saturado y acidificado y 0.75 g de caolín.
Se agregó 800 uL de Folin, se agito y se dejó reposar por 5 min, Luego se añadió 400 uL de Na2CO3 se volvió agitar
Se agregó 6400 uL de agua desionizada, se homogenizo reposo 2 min y se procedió a la lectura a 700 nm.
e) Preparación de la curva estándar
Se pesó con precisión 25 mg de ácido tánico, se transfirieron a una fiola de 100 mL y se completó el volumen con agua destilada.
Posteriormente se midió exactamente 2 mL y se pasaron a una fiola de 10 ml enrasando con agua destilada.
Se tomaron 8 tubos de ensayo y se adicionó a cada uno los volúmenes de los reactivos según se muestra en la tabla además en el orden respectivo se añadieron la solución de ácido tánico.
Luego el reactivo de Folin, se agitó con un agitador Vortex y se dejó reposar por 5 min. Luego se añadió la solución de Na2CO3.
Se volvió a agitar y se le agregó agua destilada para homogenizar.
Se mantuvo en reposo 2 min y luego se realizó la lectura de las absorbancias en el espectrofotómetro a 700 nm.
Tabla 13. Preparación de la curva estándar
Tubo
Solución de ácido tánico
(uL)
Reactivo de Folin
(uL)
Solución Na2CO3
(uL)
Agua destilada
(uL)
Concentración de ácido
tánico (ug/mL)
Blanco 300 300 150 3000 0
T1 150 300 150 3150 0,75
T2 300 300 150 3000 1,5
T3 600 300 150 2700 3
T4 900 300 150 2400 4,5
T5 1200 300 150 2100 6
T6 1500 300 150 1800 7,5
T7 1800 300 150 1500 9
Figura 21. Procedimiento esquematizado para preparación de la curva estándar.
BLANCO Se pesó con precisión 25 mg de ácido tánico, se transfirieron a una fiola de 100 mL para enrasar
Se tomó
exactamente 2 mL y se pasaron a una Fiola de 10 ml
Se tomó un tubo donde se agregó 300 uL de agua en vez de ácido tánico luego 300 uL del reactivo Folin.
Se agito y se dejó reposar por 5 min. Luego se añadió 150uL de la solución de Na2CO3 a cada tubo, se volvió a agitar
Se tomaron 7 tubos de ensayo y se adicionó a cada uno los tubos 150 uL, 300 uL, 600 uL, 900 uL, 1200 uL, 1500 uL y 1800 uL de ácido tánico , luego 300 uL del reactivo Folin a cada uno.
Se mantuvo en reposo 2 min y se procedió a leer las absorbancias a 700 nm.
Se le agregó agua destilada para homogenizar 3150 uL ,3000 uL, 2700 uL, 2400 uL, 2100 uL, 1800 uL y 1500 uL respectivamente y 3000 uL de agua para el blanco.