5.3.1 Modificación superficial de las NAg
El procedimiento que se siguió para la modificación superficial de las NAg con el agente de modificación 3-aminopropil-trimetoxisilano (APTMS) en una relación NAg:APTMS (1:0.5) y (1:1) se detalla a continuación:
En un matraz bola de 100 mL se adicionaron las NAg y el agente de modificación en 50 mL de octano. Una vez que fueron agregadas las NAg, el sistema se calentó a 80 °C y se mantuvo con agitación y reflujo durante 6 horas. Después de transcurrido el tiempo de reacción, se decantó el solvente y el material obtenido se dejó secar durante toda la noche en una estufa a 80 °C. Posteriormente con el propósito de remover cualquier residuo de disolvente que pudiera estar presente las NAg modificadas fueron liofilizadas para después ser caracterizadas por diferentes técnicas como Microscopia electrónica de transmisión
48 (HRTEM), Espectroscopia de FT-IR, Difracción de Rayos X y Microscopia de fuerza atómica (AFM).
5.3.2 Preparación de los nanocompuestos
La obtención de los nanocompuestos se llevo a cabo a partir de la encapsulación de las NAg modificadas mediante la técnica de polimerización en miniemulsión sin y con agente coestabilizante (HD), variando el contenido de surfactante e iniciador. La reacción de polimerización se realizó en un reactor enchaquetado de vidrio de 100 mL donde se preparó la solución micelar surfactante/agua (CTAB/H2O), la cual es agitada a 430 rpm durante 30 minutos (Figura 5.7a). Antes de que finalice el tiempo de agitación se prepara una dispersión en un vaso de precipitado de 100 mL que contiene tanto el iniciador, como las NAg modificadas y el monómero (St o MMA), la dispersión anterior es sonificada durante 3 minutos continuos en un baño de hielo para asegurar que el iniciador no se descomponga prematuramente, posteriormente es incorporada al reactor que contiene la solución micelar y juntas son sonificadas durante 2 minutos más con el objetivo de lograr una miniemulsión estable y obtener así una mejor dispersión de las nanopartículas en el sistema de polimerización. Se monta el reactor nuevamente tal y como se muestra en la figura 5.7b bajo una atmósfera inerte (N2), una vez que han transcurrido 30 minutos de ambientación, se coloca el baño de agua fijado a 80 °C. Las diferentes reacciones de polimerización se llevaron a cabo a una velocidad de agitación de 430 rpm.
Figura 5.7. a) Solución micelar, b) Polimerización del nanocompuesto.
a) b)
49 La adición del ácido metacrílico se efectúo de dos formas: 1) Desde el inicio de la reacción y 2) 40 minutos después de haber colocado el calentamiento, es importante mencionar que en ambos casos su adición fue posterior a los 5 minutos totales de sonificación. Mientras que el HD es adicionado al monómero previo a su sonificación con la finalidad de estabilizar a las partículas.
Durante la reacción se determinó la cinética de reacción que consistió en tomar muestras a diferentes tiempos, en viales de 10 mL previamente pesados junto con una solución acuosa de hidroquinona usada como inhibidor a una concentración de 0.4 g/100 mL de solución.
Las muestras fueron congeladas a una temperatura de – 50 °C durante 2 horas y después liofilizadas durante 16 horas.
Posteriormente se realizaron los cálculos de conversión para cada muestra, en base a la siguiente fórmula:
Conversión % = fracción polímero
fracción monómero ∗ 100
5.3.3 Eficiencia de la encapsulación
El procedimiento llevado a cabo para calcular la eficiencia de encapsulación de las NAg en el látex obtenido fue el descrito por Erjun Tang et al. [7, 102] para la preparación de nanocompuestos de ZnO/PS y Zn/PMMA el cual consiste en la precipitación de la partícula de látex compuesta por centrifugación a 12,000 rpm durante 30 minutos. La solución sobrenadante fue cuidadosamente separada del residuo y las partículas compuestas estables fueron lavadas con agua desionizada cuando el monómero empleado fue MMA y con lavados de tolueno para el nanocompuesto de PS. Esta operación se repitió hasta obtener una solución sobrenadante relativamente clara (Figura 5.8).
Figura 5.8. Látex polimérico sometido a centrifugación, a) primer lavado y b) después de 4 lavados.
a) b)
50 Posteriormente la eficiencia de la reacción de encapsulación se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación:
𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑐𝑎𝑝𝑠𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 % = 𝐷
𝐸 100 %
Donde D (g) es el polímero encapsulado sobre las NAg modificadas y E (g) es el total de polímero. La cantidad de polímero fue determinada por la pérdida en peso cuando las nanopartículas compuestas fueron calentadas hasta 800 °C en un termoanalizador.
5.3.4 Pruebas microbiológicas
Con el fin de evaluar la actividad antibacteriana de los látex obtenidos en los diferentes sistemas de polimerización, se realizó un estudio para las bacterias Escherichia coli y Staphylococcus aureus. La preparación de los inóculos para cada una de las bacterias se describe a continuación:
Escherichia coli y Staphylococcus aureus
A partir de un cultivo fresco (18 – 24 horas) en placa, se tomaron con un asa para cultivo 5 unidades formadoras de colonias (UFC) en un tubo con solución salina estéril al 0.9% y se incubaron a 35 °C durante 2 horas. La turbidez se ajustó con BaSO4 hasta una escala 0.5 de Mc Farland. La densidad del inóculo se verificó mediante un espectrofotómetro a 625 nm a 0.8 – 0.10. De esta forma, se obtuvo una suspensión de 1.5 x 108 UFC/mL. Posteriormente se prepararon 25 alícuotas de la muestra. Esta suspensión se utilizó en los primeros 15 – 30 minutos, para la preparación de las placas de cultivo. Con la ayuda de un hisopo de algodón estéril, se toma la muestra, retirando el exceso de líquido al presionar contra las paredes del tubo.
Enseguida, en una base de agar Sal Manitol con un pH de 6.86 ± 0.2, preparado de acuerdo al estándar del fabricante, y esterilizado a 121 °C a 15 libras de presión, colocado en cajas Petri e incubado durante 24 horas previas a la siembra para control de calidad, se realizó la siembra de la muestra mediante el método de estriado. Se incubó a una temperatura de 35 – 37 °C durante 24 horas, después de las cuales se realizó un hueco de 8 mm de diámetro en cada caja de Petri con la bacteria, donde se colocaron 100 µg de cada una de las muestras del blanco o control y de las muestras tratadas. Se realizaron lecturas a las 24 y 48 horas.
51 La medición del diámetro de inhibición se realizó con una regla milimétrica al milímetro más cercano observado.
El porcentaje de Inhibición de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) se calculó con la siguiente ecuación:
% 𝐼 = 𝐵 − 𝐴
𝐵 100
Donde:
% I = Porcentaje de Inhibición, A representa el promedio de Inhibición de UFC viables en las muestras tratadas y B el promedio de Inhibición de UFC viables en muestras control o blancos.
Para la determinación del crecimiento bacteriano por el método de suspensión cuantitativa por dilución y conteo, se utilizaron los tubos que contenían una solución de NaCl al 0.9%
con el inóculo bacteriano, los cuales fueron revolucionados en un agitador vortex durante 2 horas a 37 °C.
La concentración del inóculo se controló al realizar diluciones decimales seriadas 1:10 y sembrando 0.1 mL de las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 en una placa de agar Sal Manitol para cada una de las muestras. Las placas se incubaron a una temperatura constante de 37 °C con una humedad relativa de 90 % durante 24 horas. Todos los inóculos se utilizaron dentro de la primera hora de ser preparados y se consideraron válidos los conteos entre 20 y 200 UFC/mL.
Se tomó una alícuota de 10 mL de cada tubo, se realizaron diluciones seriadas en solución salina 1/10 (hasta 10-6), y se sembró en placas de agar Sal Manitol. Posteriormente se realizó en cada caja Petri con la bacteria, un hueco de 8 mm de diámetro y se colocaron 100 µg de cada una de las muestras del blanco o control y de las muestras tratadas.
Después de 24 y 48 horas de incubación a 37 °C, se contaron las colonias y las unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL), a partir del conteo de colonias y la dilución respectiva. En base logarítmica, se realizó el cálculo de las unidades formadoras de colonias (log10 UFC/mL).
52 Los valores se expresaron como la reducción del crecimiento bacteriano:
𝑅𝐶𝐵 = log 𝐵
𝐴 − log 𝐶
𝐴 = log 𝐵 𝐶 Donde:
RCB = Reducción de crecimiento bacteriano.
A = Promedio de UFC viables inmediatamente después de la colocación de las muestras tratadas.
B = Promedio de UFC viables de la muestra blanco o control a las 48 horas de la incubación.
C = Promedio de UFC viables de la muestra tratada a las 48 horas de la incubación.