Determinación de aminoácidos libres

Los aminoácidos libres se identificaron y cuantificaron mediante derivatización y análisis por RP-HPLC, siguiendo el procedimiento utilizado por Pino (2007). Se tomaron 10 ml del extracto obtenido para la determinación del NS en agua (Figura 7), y se mezclaron con 2 ml de ácido sulfosalicílico al 15% (ASS), usado como agente precipitante previo al análisis de aminoácidos obteniendo una concentración final de un 2,5% p/v de ASS. El pH del sobrenadante obtenido tras una centrifugación se ajustó a un valor de 4.0 y se almacenó en un recipiente adecuado a -80°C hasta la realización del análisis cromatográfico.

La derivatización en precolumna fue realizada con o-phthaldialdehyde (OPA) como proponen Jones et al. (1981).

La separación cromatográfica se llevó a cabo a 30°C utilizando para ello una columna C18 ODS Ultrasphere (250 x 4,6 mm y tamaño de partícula 5 µm) (Beckman Instruments, Inc, Fullerton, CA, USA). La configuración del fluorímetro fue: 16 µl flujo de célula, excitación en rango de 305 a 375 mm, emisión entre 430 y 470 nm, tiempo constante de 0,5 segundos y una sensibilidad de 0,02 unidades. El gradiente de elución usado para la separación de los derivados del OPA fue:

solvente A: tetrahidrofurano:metanol:acetato sódico 0,05 M y pH 5,9 (1:19:80), y solvente B: metanol:acetato sódico 0,05 M y pH 5,9 (80:20). El programa de gradientes se definió de la forma siguiente: composición inicial 0%B, paso isocrático a 0% de B durante 1 minuto, paso lineal hasta 14% de B en 5 minutos, paso isocrático de 14% de B durante 5 minutos, paso lineal hasta 50% de B en 5 minutos, paso isocrático de 50% de B durante 4 minutos, paso lineal hasta 100%

de B en 12 minutos, paso isocrático de 100% B durante 8 minutos. El flujo de operación se fijó en 1,2 ml/minuto.

La cuantificación de los aminoácidos libres se realizó mediante la utilización de patrones externos. Se prepararon soluciones de distintas concentraciones, comprendidas entre 0,2 mg/l y 37 mg/l, de los siguientes aminoácidos: ácido aspártico (Asp), serina (Ser), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), arginina (Arg), treonina (Thr), alanina (Ala), tirosina (Tyr), valina (Val), metionina (Met), lisina (Lis), isoleucina (Ile), leucina (Leu), fenilalanina (Phe), glutamina (Gln), asparagina (Asn), triptófano (Trp), ácido gama-aminobutírico (GABA), taurina (Tau) y ornitina (Orn), que fueron inyectadas para examinar la relación lineal entre cantidad de aminoácido y área de los picos obtenidos. Con estas soluciones se procedió de la misma manera que con las muestras de queso y se prepararon las curvas de calibración para la cuantificación de los mismos.

Validación del método RP-HPLC para aminoácidos libres.

Los 21 aminoácidos patrones inyectados fueron resueltos en 45 minutos. Se inyectaron cantidades crecientes de aminoácidos estándares (entre 0,2 mg/L y 40 mg/L), para examinar la relación lineal entre las cantidades de aminoácidos estándares y el área de los picos obtenidos. El rango lineal, el coeficiente de determinación, repetitividad y los parámetros de validación del método analítico, incluyendo la sensibilidad analítica, el límite de detección y límite de cuantificación obtenido, se muestran en la Tabla 4. En general, los resultados de los parámetros de validación fueron fiables y satisfactorios.

Tabla 4. Validación de la determinación simultánea de aminoácidos en una curva de calibrado

La repetibilidad es un parámetro que contribuye a estimar la precisión del método. La precisión está relacionada con la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio o central y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el método se aplica repetidamente a múltiples alícuotas de una muestra homogénea (Quattrochi et al., 1992). La repetibilidad se estimó mediante 9 determinaciones de concentraciones diferentes con tres repeticiones de cada una. La linealidad de un método analítico cuantifica a la proporcionalidad entre la concentración de un analito y su respuesta. Es recomendable la realización de un mínimo de 5 determinaciones con concentraciones diferentes para establecer linealidad. El coeficiente de correlación de la muestra (r) es una estimación de la asociación lineal que existe entre dos variables x e y (Walpole y Myers, 1991). El coeficiente de correlación se utilizó para evaluar el ajuste al modelo lineal propuesto:

dónde “y” es la señal medida, “a” es la ordenada al origen, “b” es la pendiente y

“x” la concentración del analito en estudio. Para cada aminoácido se obtuvo una curva de calibración después de inyectar y analizar 9 concentraciones diferentes por triplicado.

Para cada curva se aplicó el modelo de regresión lineal por mínimos cuadrados y se obtuvieron los parámetros de la ecuación (1).

La sensibilidad de un método analítico corresponde a la mínima cantidad de analito que puede producir un resultado significativo. La sensibilidad de la técnica se estimó calculando los siguientes parámetros: sensibilidad analítica, límite de detección y límite de cuantificación.

La sensibilidad analítica es una relación entre la pendiente de la curva de calibración y la desviación estándar de la medida. La sensibilidad analítica (γ) se calculó según Arancibia y Escandar (1999):

siendo SR la desviación estándar de los residuos y “b” la pendiente de la recta. El límite de detección (LD), se concreta como la menor concentración de analito que puede detectarse, pero no necesariamente cuantificarse en una muestra, en las condiciones establecidas y se expresa en unidades de concentración. El LD se calculó según lo propuesto por la Food and Drug Administration (FDA, 1996):

donde “S^Rbc” corresponde a la desviación estándar de los residuos correspondientes a una curva de calibrado en la zona de bajas concentraciones del

analito en estudio. El límite de cuantificación (LQ) corresponde a la menor concentración del analito que puede determinarse con precisión y exactitud razonables en las condiciones establecidas y se expresa también en unidades de concentración. Al igual que el LD, el LQ se calculó según lo propuesto por la Food and Drug Administration (FDA, 1996):

Se denomina rango lineal al intervalo comprendido entre la concentración mínima y máxima de analito para el cual el método ha sido probado y dentro del cual se puede efectuar la medida por interpolación en una curva estándar (Quattrochi et al., 1992). El rango lineal se expresó como el intervalo comprendido entre el LQ y la máxima concentración del analito en estudio para la cual se probó el método.

En la Figura 9 se muestra un cromatograma de los patrones de aminoácidos necesarios para realizar la curva de calibrado.

Figura 9. Cromatograma RP-HPLC de los patrones para la determinación simultanea de los aminoácidos necesarios para la elaboración de curvas de calibrado