Obtención y caracterización de parásitos knockout para TSSA

A pesar de los escasos precendentes exitosos de obtención de knockouts (KOs) por la técnica de reemplazo alélico en T. cruzi^[171], la información genómica para TSSA disponible al inicio de este trabajo de Tesis[133, 134, 143]

indicaba que era un gen de copia única (o un bajo número de copias) lo que, sumado a su expresión restringida al estadio de tripomastigote^[133], lo convertía en un candidato factible para la aplicación de esta técnica. Brevemente, partiendo de un vector que contenía clonadas las secuencias 5´y 3´ intergénicas correspondientes al locus TSSAII obtenidas del genoma de CL Brener^[134](T-easy-5' 3' TSSA, figura MM 2) se amplificó por PCR cada una de éstas y se clonaron en vectores que pTcR-HG Neo+ GB y pTcR-HG Hyg+ GB^[172]. De esta manera, se obtuvieron casetes de resistencia a neomicina o higromicina de transcripción independiente (ya que cada una de estas resistencias se encontraba bajo la regulación transcripcional de secuencias HX1 y GAPDH I-II en el 5´ y 3´, respectivamente) flanqueados por regiones de recombinación específicas para el locus de TSSA (figura MM 1). Estos casetes serían transfectados de manera secuencial para lograr la deleción en los diferentes loci de TSSA.

Usando la construcción pTcR-HG Neo+ GB linealizada se procedió con la transfección de las cepas CL Brener y RA (ambas cepas híbridas TcVI). Luego del clonado de los parásitos, el cual sólo fue posible con la cepa RA, se analizaron sus genotipos por PCR. En el locus TSSAII encontramos la inserción del casete de resistencia (figura 12 y datos no mostrados). Sin embargo, otros estudios nos permitieron evidenciar la presencia de al menos 3 copias del gen de TSSAII en tándem en estos parásitos (datos no mostrados), lo que sugirió que i) el reemplazo alélico había sido parcial y ii) que existían más copias de TSSA que las predichas en el genoma de CL Brener^[134]. Por otro lado, no se encontró ningún clon mutante para el locus de TSSAIII (figura 12). Luego de la diferenciación a tripomastigotes, se realizó el análisis por Western blot en el cual se confirmó la expresión de TSSAII en todos los clones, consistente con la presencia de copias del gen adicionales (figura 12), por lo que decidimos no continuar con el protocolo.

41 Figura 12: Análisis de genotipificación por PCR y Western blot de los clones de T. cruzi (RA) luego del protocolo de recombinación homóloga para la obtención de parásitos KO para TSSA. (A) Reacciones de PCR sobre los loci TSSAII y TSSAIII en búsqueda de la inserción del casete de recombinación (A). Como control se hicieron reacciones con el plásmido pTcR-HG Neo + GB como templado y sin templado (-). En la parte inferior del panel A se esquematizaron las regiones interrogadas en cada reacción de PCR y los productos esperados en cada caso. *En el caso del locus TSSAIII el esquema coincide con el mostrado en la figura 14. (B) Análisis de la expresión de TSSA por Western blot en los tripomastigotes obtenidos por diferenciación de distintos clones mutantes.Como control de carga se usó la proteína GDh.

II.I.II. Aproximación por la técnica de CRISPR/Cas9

Debido a los resultados obtenidos con la técnica de recombinación homóloga clásica, decidimos aplicar la técnica de CRISPR/Cas9 que recientemente había sido implementada en T. cruzi^[173,

174]. Para aprender esta tecnología, establecimos una colaboración con el Dr. Roberto Docampo y a fines de 2016 realicé una pasantía de 3 meses en su laboratorio. CRISPR/Cas9 se basa en el

42 direccionamiento de la nucleasa Cas9 mediado por secuencias de ARN específicamente diseñadas (sgRNAs) hacia un gen blanco de interés^[175]. Las secuencias target (protospacers) de TSSA seleccionadas fueron amplificados junto con el ARN scaffold para obtener sgRNAs. Se clonaron en el vector Cas9plasmid-pTREX-n que codifica para la nucleasa Cas9 en fase con la proteína EGFP conteniendo una secuencia de direccionamiento al núcleo. En paralelo se diseñó el ADN donor que serviría como templado de la recombinación homóloga luego de la edición por la nucleasa Cas9. Esta secuencia constó de un casete de resistencia a blasticidina con secuencias regulatorias HX1 y GAPDH I-II iguales a las usadas en la sección anterior (figura MM 5). A diferencia del sistema anterior, en CRISPR/Cas9 solo se usaron 100 pb flanqueantes con homología a las regiones intergénicas 5´ y 3´de TSSA (II y III, figura S 3), lo cual es suficiente para favorecer la recombinación en el locus de interés^[176] (figura MM 5). Una vez amplificado el casete de resistencia con las regiones de homología (HR) (ADN donor lineal), se clonó en un vector pGEMT-easy (ADN donor circular, figura MM 2). Decidimos realizar las transfecciones en la cepa RA por tratarse de una cepa autóctona^[177], altamente virulenta y sistemáticamente usada en modelos de infección in vivo en diferentes laboratorios^[178-181]. Los esquemas de transfección utilizados se detallan en la tabla MM 3: brevemente, se transfectaron epimastigotes con una mezcla de los 4 vectores (cada uno con un sgRNA) en presencia de ADN donor (lineal o circular); como control se usó un sgRNA de secuencia mezclada que no tiene blancos aparentes en el genoma de T. cruzi (previamente usada ^[173]). Los parásitos se seleccionaron usando los antibióticos blasticidina (dado que el ADN donor presenta una secuencia que codifica para la blasticidina-S-deaminasa) y G418 (ya que el vector Cas9plasmid-pTREX-nposee un gen que codifica para la proteína neomicina fosfotransferasa) según correspondiera en cada caso. Una vez seleccionados (tratamientos i y ii en la tabla MM 3), se analizó la expresión del sistema Cas9- EGFP por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo, usando como control la cepa RA salvaje (figura 13 A y B). Lamentablemente, no fue posible recuperar la población de parásitos transfectados con el sgRNA de secuencia mezclada.

43 Figura 13: Análisis de expresión de la proteína Cas9-EGFP en epimastigotes de la cepa RA. Se analizó por citometría de flujo (A y C) y por microscopía de fluorescencia (B) la expresión de la proteína Cas9- EGFP en las transfecciones realizadas con ADN donor lineal (mostrados en azul y tonos de azul) o ADN donor circular (mostrados en rojo y tonos de rojo). Como control se usó la cepa RA salvaje (RA, mostrada en negro).

Los parásitos provenientes de la transfección con ADN donor lineal mostraron niveles homogéneos de la proteína Cas9-EGFP en toda la población. En contraste, la población transfectada con ADN donor circular pareció estar compuesta por tres subpoblaciones con niveles de expresión diferencial de Cas9-EGFP (una de ellas con niveles similares a la cepa RA salvaje).

El análisis por microscopía de fluorescencia evidenció la acumulación nuclear de Cas9-EGFP en ambos tratamientos y confirmó la presencia de parásitos sin expresión de EGFP en la

44 transfección originada con el ADN donor circular. A continuación, se procedió con el clonado por dilución límite. Se analizaron 10 clones en total, 3 provenientes de la transfección con ADN donor lineal y 7 provenientes de la transfección con ADN donor circular. Ninguna de las poblaciones/clones de epimastigotes mostró deficiencias groseras en el crecimiento o fenotipos aberrantes en el estadio epimastigote (experimentos en progreso). Todos los clones se analizaron por citometría al igual que las poblaciones parentales y mostraron expresión de EGFP aunque en menores niveles que sus poblaciones de origen (figura 13 C).

Figura 14: Esquema de los loci de TSSA en el genoma de la cepa TCC^[182] y los productos de recombinación esperados de acuerdo al diseño planteado del sistema CRISPR/Cas9. En los paneles A y D se muestran dos esquemas de los fragmentos de los contigs donde se encuentran las copias de TSSAII y TSSAIII en el genoma de la cepa TCC con sus nombres (TCC55 y TCC216, respectivamente, ver tabla 4 para mayor detalle). El panel B muestra un esquema ampliado de la secuencia de TSSAII y las RHs usadas (RH 5’ y 3’) y en el panel C se esquematizó el producto de recombinación final esperado. Se graficó también el locus de TSSAIII (D) y el producto de recombinación esperado para el mismo (E). Se indicaron con el mismo color los pares de oligonucleótidos usados para la genotipificación y el tamaño esperado para los amplicones en cada caso. Los productos de amplificación se muestran en la figura 14.

En paralelo a estos estudios, el grupo del Dr Carlos Robello reportó en 2018 la secuenciación y anotación mejorada del genoma de la cepa TCC (TcVI) usando la tecnología de lecturas largas PacBio (Pacific Biosciences)^[182]. De acuerdo a estos resultados, el gen TSSAII se encuentra ordenado en un tándem de 12 copias (de ~28 Kb) y el gen TSSAIII en otro locus en copia simple totalizando 13 copias de TSSA en la cepa TCC. Partiendo de esta información y en

45 base al diseño experimental planteado se diseñaron oligonucleótidos que permitieran interrogar los posibles rearreglos ocurridos en nuestros parásitos RA editados (figura 14 y tabla MM 4). Se purificó ADN genómico de estas poblaciones (y clones derivados de ellas) y se usaron como templado en distintas reacciones de PCR usando como control ADN genómico extraído de la cepa RA salvaje (figura 15). Inicialmente, se usaron oligonucleótidos específicos para amplificar el gen TSSA (incapaces de discriminar entre TSSAII y TSSAIII), y se obtuvo un amplicón compatible con la presencia de al menos 1 copia de este gen en los clones 1,2 y 3 (obtenidos de la transfección con ADN donor lineal), en las transfecciones totales y en la cepa RA. En contraste, no se observó amplificación en ninguno de los clones provenientes de la transfección con ADN donor circular (clones 4 a 10). Al usar oligonucleótidos que hibridan en las zonas intergénicas de TSSA (esquematizados en naranja en las figuras 14 y 15, tabla MM 4) obtuvimos amplicones compatibles con la ausencia de rearreglos en los clones 1, 2 y 3 y en las poblaciones transfectadas. Los clones 5, 6 y 8 mostraron productos de amplificación diferenciales, aunque ninguno de ellos es compatible con el producto esperado en caso de recombinación con el ADN donor provisto (~1500 pb). Debido a la similitud de secuencia entre TSSAII y TSSAIII y sus secuencias intergénicas (figura S 3) existía la posibilidad de haber editado secuencias en este último locus. Para evaluar esta posibilidad, diseñamos oligonucleótidos específicos para el locus TSSAIII. Los productos de amplificación obtenidos para los clones 1, 2, 3, 5 y 8, así como en las transfecciones totales y la cepa RA fueron compatibles con el tamaño esperado ante la ausencia de edición en este locus.

Interesantemente, usando oligonucleótidos que flanquean el tándem de TSSAII, los cuales se encuentran distanciados por ~28 Kb, se obtuvo un producto de amplificación de ~4 Kb en los clones 4, 5,7, 8 y 10, lo cual es compatible con una edición total/parcial en el locus de TSSAII. En el resto de los clones/poblaciones analizadas no se obtuvo ningún producto de amplificación, probablemente porque el largo de este tándem supera el límite de procesividad de las polimerasas tradicionales^[183]. El producto de amplificación obtenido para el clon 10 fue secuenciado y se verificó la deleción total de las copias del gen TSSAII. Las mutaciones provocadas por la Cas9 fueron reparadas por el mecanismo de unión de extremos mediado por microhomología (MMEJ), sin embargo no fue posible identificar cuáles fueron las secuencias usadas por el mecanismo

46 MMEJ debido a las características repetitivas del locus TSSAII. Además, se verificó la ausencia de secuencias relacionadas con el ADN donor.

Figura 15: Genotipificación de parásitos editados por CRISPR/Cas9 usando como templado el ADN genómico obtenido de las transfecciones totales (con ADN donor lineal o circular) o de los clones provenientes de las mismas. Se realizaron reacciones con ADN de la cepa RA salvaje (RA) y sin templado (-) como controles. A la izquierda se indica el locus genómico o secuencia genética que se analizó y a la derecha las flechas de colores se corresponden con los oligonucleótidos esquematizados en la figura 14.

Los asteriscos indican los productos que se secuenciaron y se corroboró su identidad con la secuencia esperada de acuerdo al diseño del análisis genotípico.

Los análisis genotípicos también mostraron que en todas las poblaciones transgénicas se obtuvo un producto de amplificación compatible con el gen de la blasticidina-S-deaminasa.

Finalmente, para evidenciar la presencia de la resistencia a blasticidina en el contexto de los loci de TSSA, se usaron combinaciones de oligonucléotidos específicos para ambas secuencias (figuras 14 y 15). En la primera combinación obtuvimos un producto de amplificación en ambas transfecciones originales y en el clon 3. La secuenciación de este último corroboró la identidad del amplicón. Sumado a esto, la PCR recíproca mostró que el clon 3 y los clones 1 y 2 podrían

47 tener una inserción del ADN donor en el contexto del tándem TSSAII, al igual que la población que les dio origen (figura 15).

El agregado de secuencias regulatorias independientes para el ADN donor no había sido probado hasta el momento en el contexto de CRISPR/Cas9. Sin embargo, las variantes de ADN donor: lineal (obtenido por PCR) y circular (transfección con un plásmido) habían sido reportadas previamente con resultados favorables[173, 184]

. De la transfección con ADN donor lineal obtuvimos clones con ediciones génicas similares entre ellos y compatibles con una deleción parcial en el locus de TSSAII (clones 1, 2 y 3). Debido a la mejor caracterización obtenida para el clon 3, decidimos continuar trabajando con éste a modo de control. En cambio, de la transfección con ADN donor circular obtuvimos clones con posibles deleciones totales en el tándem TSSAII (clones 4, 7 y 10) y clones con posibles reorganizaciones en este locus (clones 5, 6 y 8). Más interesante aún, obtuvimos un clon (clon 9) para el cual no fue posible obtener amplicones relacionados a ningún loci de TSSA, con lo cual podíamos inferir la existencia de rearreglos de mayor extensión que superaban la capacidad de análisis provista por las reacciones de PCR realizadas. Teniendo en cuenta esto, decidimos continuar trabajando con los clones 9 y 10 los cuales representaron dos eventos interesantes desde el punto de vista de las ediciones génicas obtenidas por el sistema CRISPR/Cas9.

II.I.II.I. Análisis fenotípico in vitro de parásitos editados en TSSA

Considerando que TSSA es una proteína específica del estadio de tripomastigote, con el objetivo de evaluar fenotípicamente los clones de interés (3, 9 y 10), se procedió a ciclarlos in vitro. Una vez obtenidos, se realizaron ensayos de Western blot revelando con anticuerpos anti-TSSA y anti-GDh como control de carga (figura 16 A). En concordancia con los resultados de la genotipificación, solo el clon 3 (el cual mostró una posible deleción parcial de TSSA) mostró niveles detectables de la proteína TSSA y similares a la cepa salvaje. Estos resultados fueron corroborados en ensayos de IFI (figura 17).TSSA muestra altos niveles de homología con la familia de genes TcMUC[113, 133]

las cuales codifican para las mucinas del estadio de tripomastigote (figura 16). Como consecuencia, consideramos que genes pertenecientes a esta familia podrían haber sido editados por el sistema CRISPR de manera inespecífica. Debido a la complejidad genómica de esta familia (~900-1000 copias por haplotipo)[113, 135, 182]

evaluamos de

48 manera preliminar e indirecta su posible edición, a través de la caracterización de los productos que codifican. Para ello, realizamos una marcación de aceptores de ácido siálico (principalmente mucinas) en tripomastigotes^[139] (figura 16). Brevemente, el protocolo constó de la incubación de tripomastigotes con un análogo de ácido siálico modificado con un grupo azida (Neu5Az); luego de la incorporación de este residuo en la superficie de los parásitos mediada por la trans-sialidasa endógena, el grupo azida es acoplado covalentemente a través de una reacción de click a un epitope FLAG el cual se revela por Western blot u otras técnicas inmunoquímicas^[185]. Como resultado de esta marcación se obtuvo un patrón de bandas similar, de tamaños entre 55 y 180 kDa y compatible a lo reportado (Lantos et al, 2016) en todas las líneas analizadas (figura 16).

Dado que las mucinas son el componente mayoritario en la superficie de T. cruzi 10^6-7 moléculas por parásito)[113, 186]

, pensamos que si el procedimiento realizado hubiese afectado genes TcMUC distintos de TSSA, se producirían aberraciones en la la morfología de la cubierta del parásito. Sin embargo, mediante microscopía electrónica de barrido (MEB) se corroboró la integridad de la membrana de los tripomastigotes de las distintas líneas obtenidas (figura 16 C).

Dado que TSSA funciona como una adhesina involucrada en la interacción del tripomastigote y la célula huésped, realizamos ensayos de infección en monocapas de células para evaluar el fenotipo de los mutantes. Brevemente, se incubaron tripomastigotes de las distintas líneas (<10% de amastigotes) durante 4 h con monocapas de células Vero, se lavó exhaustivamente para eliminar los parásitos no internalizados y se incubó por 60 h adicionales.

Las infecciones se cuantificaron luego de contrastar los núcleos celulares y parásitos (mostrados en celeste y verde, respectivamente, en la figura 18) para ser analizadas por IFI. Se contabilizó el total de células y las células infectadas usando el software Fiji y se relativizó al porcentaje de infección obtenido para la cepa RA salvaje. Los clones 9 y 10 mostraron una menor infectividad (15% y 30%) comparados con la cepa RA salvaje. El clon 3, en cambio, mostró un infectividad similar al de la cepa salvaje lo cual correlaciona con sus niveles de expresión de TSSA. Dado que el clon 3 también expresa la proteína Cas9, este resultado también descarta efectos inespecíficos en la infectividad del parásito asociados a la transfección y/o manipulaciones subsiguientes.

49 Figura 16: A. Análisis de expresión de TSSA por Western blot. Se cuantificó la relación TSSA/GDh para cada cepa (círculos vacíos) y se relativizó a la relación obtenida para la cepa RA salvaje. Se graficó la media y SD. *** p<0,001 vs RA, ns: no significativo, Sidak´s post-test.Se esquematizaron y marcaron los porcentajes de homología entre secuencias proteicas deducidas para los grupos TcMUC I, II y TSSA (B).

SP: péptido señal; GPI: secuencia para el anclaje a membrana por GPI. C. Análisis de conservación del patrón de mucinas. Se utilizó el protocolo de marcación con sialil-azida publicado por Lantos y col.

2016^[187]. D. Estudio de la integridad de la membrana de los tripomastigotes por MEB.

50 Figura 17:

Marcación de tripomastigotes de los clones 3, 9 y 10 y de la cepa RA sal- vaje con anti- TSSA y aná- lisis por IFI.

51 Paralelamente, se ensayó la infectividad de estos parásitos en un modelo tridimensional (esferoides de células HeLa)[103, 188]

. Brevemente, los esferoides (figura 18 A, en rojo) se incubaron durante toda la noche con las diferentes líneas de T. cruzi previamente teñidas con CFSE (éster de succinimidil-carboxifluoresceína) (figura 18 A, en verde). Al día siguiente, se fijaron los esferoides para realizar la microscopía confocal (figura 18 A) o se disgregaron con tripsina y se fijaron posteriormente para analizar la infección por citometría de flujo (figura 18 B). En este sistema, los clones 9 y 10 mostraron una reducción del ~50% en la infectividad comparados con las cepas que expresan TSSA. El análisis de los esferoides por microscopía confocal reveló que, además de de su reducida infectividad, los clones deficientes en TSSA muestran diferencias en su nivel de transmigración (Figura 18 A). Dado que la migración de los parásitos en tejidos (y por tanto también en el esferoide) requiere de una motilidad activa, quisimos evaluar si las diferencias en la transmigración estaban relacionadas a deficiencias en la motilidad. Para ello, realizamos ensayos de migración en matrices semisólidas midiendo la velocidad y los tipos de movimiento realizados por las distintas líneas de parásitos (persistente, intermitente o tumbler)^[189]. En este ensayo los parásitos se incubaron 1 h en una matriz de colágeno tipo I previamente polimerizada o medio de cultivo y se tomaron videos de 60 segundos (2 cuadros por segundo). Posteriormente, se realizó el seguimiento manual de los parásitos cuadro a cuadro, obteniendo valores de velocidad y trayectoria de acuerdo a Dóró É y col.

2019^[189]. Todas las cepas mostraron porcentajes similares de cada uno de los tipos de movimiento tanto en colágeno como en medio de cultivo. En general, se observó un 11-16% de parásitos tumbler, un 80-87% de parásitos de motilidad intermitente y un 1-5% de parásitos de motilidad persistente, sin diferencias significativas entre las diferentes cepas ni tratamientos (Two-way ANOVA, p>0,9999) (figura 20). La velocidad promedio de los parásitos tumbler fue similar en medio y en colágeno (16,8- 22,2 µm/s; p>0,9999) sin observarse diferencias significativas entre las cepas (p>0,96). La motilidad persistente tampoco fue diferencial entre los tratamientos (44,5-68,5 µm/s en colágeno y 37,2-65,5 µm/s en medio; p>0,9999) ni se hallaron diferencias significativas entre las líneas/clones TSSA-expresantes y TSSA-no expresantes (p>0,06)(figura 20). Sin embargo, la velocidad de los parásitos de motilidad persistente en colágeno del clon 3 fue mayor que en la cepa RA salvaje (68,4 vs 44,5 µm/s, respectivamente, p<0,05). La motilidad intermitente también fue ligeramente menor para la cepa RA que para el