Desarrollo de una nueva metodología para determinar el reconocimiento entre carbohidratos y proteínas. La interacción carbohidrato-benceno
2.8 PARTE EXPERIMENTAL
Todos los reactivos se obtuvieron comercialmente y se utilizaron directamente del envase que los contenía, sin previa purificación. La cromatografía en capa fina se desarrolló sobre cromatoplacas de gel de sílice 60 de 0.20 mm de espesor (ALUGRAM SIL G/UV254) Macherey-Nagel utilizando luz ultravioleta (UV) para identificar y revelar los productos.
Los espectros de infrarrojo se determinaron en CHCl3 o bien en pastilla de KBr y con un equipo Perkin Elmer Spectrum One (FT-IR), las frecuencias de absorción se reportan en cm-1.
Los espectros de masas se determinaron a 70 eV en un espectrómetro Jeol JAS-Ax505 .
En los espectros de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) se describen más adelante, los desplazamientos químicos se reportan en la escala (ppm), utilizando TMS como referencia interna. Para indicar la multiplicidad de las señales de los espectros de RMN de protón se utilizaron las siguientes abreviaturas: señal (s) simple, (d) doble, (t) triple, (c) cuádruple, (m) múltiple y (sa) señal ancha. Las señales complejas reportadas corresponden al centro de la señal.
Los puntos de fusión se determinaron empleando un aparato Fisher-Johns usando laminillas de vidrio abierto y no están corregidos.
La purificación de los compuestos sintetizados se llevó a cabo mediante cromatografía en columna tipo flash, utilizando sílica gel Merck 230-400 mallas (0.040 – 0.063 mm).
2.8.1 Síntesis de los compuestos de interés.
Para llevar a cabo la síntesis de los compuestos permetilados se siguió la metodología descrita por Wang et al.80 A 1 g (5.15 mmol) de metil-D-piranósido se disolvió en 7 mL de sulfóxido de dimetilo, se adicionaron lentamente 10 mL (50 mmol) de una solución al 50% de NaOH, de tal forma que al terminar la adición se formara una suspensión de aspecto gelatinoso.
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Posteriormente, se adicionaron 3 mL (48.2 mmol) de CH3I. La reacción se mantuvo en agitación durante 24 h, al término de las mismas la mezcla de reacción adquiere un color blanco. Entonces se adicionan 100 mL de agua y se extrae con CH2Cl2 (3 x 100 mL). Los extractos orgánicos se combinan, se secan con Na2SO4, se filtran y se concentran al vacío.
La purificación de los compuestos para las determinaciones de calorímetría requirió un proceso diferente para los compuestos sólidos y líquidos, dado que esta técnica requiere de un grado de pureza de al menos 99.9%.
Los compuestos -galactosa permetilada (2) y -glucosa permetilada (4) son compuestos sólidos;
para la purificación de éstos fue necesario llevar a cabo dos separaciones cromatográficas en columnas consecutivas usando como soporte sílica gel y como eluyente mezclas hexano:acetato de etilo en proporciones 95:5, 90:10, 80:20. El compuesto puro que se recuperó de las fracciones de la columna, se concentró y posteriormente fue tratado dos veces consecutivas con el 10% en peso de carbón activado; para ello, el compuesto se disolvió en acetato de etilo, se adicionó el carbón activado y se dejó 3 minutos en agitación bajo calentamiento. La mezcla se filtró, se concentró al vacío. De esta forma se obtuvieron dos compuestos sólidos de color blanco, la pureza de los mismos fue determinada por cromatografía de gases-masas y ésta fue del 100%
para ambos casos.
Para el caso de los anómeros de la galactosa (1), glucosa (3) y manosa (5), los compuestos son líquidos. Para su purificación se utilizó cromatografía en columna. Se efectuaron dos columnas consecutivas usando como soporte sílica gel y como eluyente mezclas hexano:acetato de etilo en proporciones 95:5, 90:10, 80:20. El producto puro recuperado en las fracciones de la columna se concentró al vacío y después se pasó por una microcolumna que tenía como soporte carbón activado, el eluyente fue hexano. El compuesto se concentró y se determinó su pureza a través de cromatografía de gases-masas. La pureza de la -galactosa permetilada (1) obtenida fue de 99.89%, de la -manosa permetilada (5) 99.91% y de la -glucosa permetilada (3) 99.23% por lo cual este último compuesto sólo fue utilizado para los estudios de RMN y no para los de calorimetría.
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2.8.2 Estudios de RMN.
En los estudios de RMN de cambio del desplazamiento químico () se pesaron 30 mg (0.12 mmol) del carbohidrato los cuales se disolvieron en aproximadamente 0.5 mL del disolvente deuterado. Se adquirieron los espectros de 1H, 13C, DEPT, COSY, NOESY, HSQC y HMBC para confirmar la asignación completa del carbohidrato. Los espectros se adquirieron en un equipo Varian-Inova 500 MHz.
La metodología para llevar a cabo las titulaciones anisotrópicas fue la siguiente: se disolvieron 110 mg (0.44 mmol) de carbohidrato en 0.5 mL de CDCl3, posteriormente se fueron adicionando cantidades medidas (19.4 L / 0.22 mmol) de C6D6, de tal forma que para la segunda adición ya se tuviera en el tubode RMN una relación 1:1 de carbohidrato:C6D6. Se efectuaron 12 adiciones de C6D6, con lo cual se llegó a una relación 1:6 carbohidrato:benceno. Al realizar cada una de las adiciones se adquirió el espectro de 1H de RMN. Se empleó trimetil silano (TMS) como referencia interna. El procedimiento fue idéntico para la titulación anisotrópica usando ciclohexano-d12, salvo que el carbohidrato se disuelve en 0.5 mL de C6D12 y se efectuaron 12 adiciones de C6D6, también se empleó trimetil silano (TMS) como referencia interna.
Para la titulación anisotrópica en la que el agente titulante es D2O, la metodología fue similar. Se disolvieron 110 mg (0.44 mmol) de carbohidrato en 0.5 mL de C6D6, posteriormente se fueron adicionando cantidades medidas (0.7 L / 0.22 mmol) de D2O, de tal forma que para la segunda adición ya se tuviera en el tubode RMN una relación 1:1 de carbohidrato:D2O. En esta ocasión sólo se efectuaron 8 adiciones de D2O, con lo cual llegó a una relación 1:4 carbohidrato:D2O, ya que con las adiciones consecutivas de agua deuterada, se propicia la formación de una emulsión que complica el ajuste en la homogeneidad del campo magnético (shimming). Al realizar cada una de las adiciones se adquirió el espectro de 1H de RMN. Se usó como referencia interna un capilar con una solución de 3-(trimetilsilil) propionato de sodio (TSP) en D2O para el espectro de
1H.
Para los estudios del incremento NOE, el carbohidrato permetilado (15 mg, 0.06 mmol) se disolvió en una mezcla de disolventes C6D6-C6H6 (0.25 mL-0.25 mL) y la determinación se llevó
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a cabo usando un espectrómetro de Bruker 500 MHz. Los espectros 1D NOE diferenciales fueron obtenidos tras la irradiación de la molécula de benceno posterior a la diferencia de espectros on- resonance y off-resonance con irradiaciones selectivas en barridos alternados.
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