Capítulo 3. Metodología Experimental
3.3 Preparación de proteína aislada de cáñamo
La primera etapa para obtener proteína aislada de harina de semilla de cáñamo comercial al 50%
consiste en un desengrasado. Para llevar a cabo esta etapa, se pesaron 50 g de harina y se realizaron tres extracciones con 250 mL de hexano destilado en baño ultrasónico durante 30 min en cada extracción. Posteriormente, se separaron las fases y la harina se secó a temperatura ambiente (25 ± 3°C). Después, la harina desengrasada se llevó a una etapa de precipitación isoeléctrica de proteínas. Esta etapa inició con la combinación de la harina previamente desengrasada con 1 L de agua desionizada, formándose una suspensión. Esta, se ajustó a pH 10.0 con NaOH 2 N para solubilizar la proteína mediante agitación a 35°C por 1 h. Posteriormente, esta muestra se centrifugó a 1,790 g durante 30 min. El precipitado, constituido principalmente de polisacáridos, se descartó y el sobrenadante se ajustó a un pH de 5.0 con HCl 2 N. La reducción del pH a 5.0 de la disolución indujo la precipitación de la proteína; la cual se recuperó por centrifugación (1,790 g por 10 min). Para evaluar la composición de los sólidos ricos en proteínas se adquirió un espectro FTIR (Tang et al., 2006). El sólido se combinó con 300 mL de buffer de fosfatos, pH 7.3, y se dejó en agitación por 24 h para mejorar la solubilización de la proteína. La concentración del aislado proteico de cáñamo fue determinada a partir de UV/vis y espectros de FTIR para la construcción de curvas de calibración.
41 Figura 16. Obtención de la proteína aislada de cáñamo
3.3.1 Determinación de la pureza de la proteína aislada de harina de cáñamo
La pureza de la muestra de proteína aislada de harina de cáñamo se determinó empleando dos métodos. El primero fue el método de Biuret, basado en la medición espectrofotométrica de un complejo formado por la reacción del reactivo de Biuret con la proteína (Krohn, 2002). El segundo método implicó el uso de IR con estándares, muestras y control positivo preparados en fase sólida. Las diluciones se llevaron a cabo con goma arábiga. Los estándares se prepararon con caseína y el control fue la proteína de chícharo con pureza del 80%. Las mediciciones se llevaron a cabo por espectrofotometría de IR por reflectancia total atenuada. La determinación de las concentraciones de proteínas se llevó a cabo a partir de cocientes de absorbancia del polisacárido/proteína (absorbancia a 1,020 cm-1/absorbancia a 1,611 cm-1). Estas determinaciones se realizaron por triplicado.
Preparación de los estándares
Preparación de estándares de albúmina de huevo al 99.8%. Se pesaron 0.5 g de albúmina y se le adicionaron 20 mL de NaOH 6 N. Posteriormente, se dejó en agitación constante a temperatura ambiente (25 ± 3°C) durante 24 h. Una vez transcurrido este tiempo se logró observar la completa
42 solubilización de la albúmina. A partir de esta disolución se prepararon cinco estándares a concentraciones de 5, 10, 15, 20 y 25 mg/mL.
Preparación de disolución de albúmina de huevo al 86% utilizado como control positivo. Se pesaron 15 mg de albúmina en un tubo para microcentrífuga y se solubilizó con 1 mL de NaOH 6 N en vórtex por 1.5 h.
Preparación de la disolución de la proteína aislada de cáñamo. Se pesaron 15 mg del polvo en un tubo para microcentrífuga y se solubilizaron en 1 mL de NaOH 6 N con agitación en vórtex durante 1.5 h.
Determinación de la pureza de la proteína aislada de cáñamo por el método de Biuret (Krohn, 2002). La reacción de las disoluciones, antes mencionadas, con el reactivo de Biuret se llevó a
cabo en una microplaca de 96 pozos con capacidad de 320-360 μL cada pozo. En la microplaca se adicionaron 30 μL de cada uno de los estándares de albúmina de huevo al 99.8% por triplicado y 120 μL del reactivo de Biuret. El blanco del estándar se preparó con 30 μL de un estándar y 120 μL de tartrato de sodio alcalino con la finalidad de minimizar la posible interferencia de la matriz de la muestra. Asimismo, se colocaron 30 μL de la disolución del aislado de cáñamo por triplicado y se combinó con 120 μL del reactivo de Biuret. El blanco de la muestra fue preparado con tartrato de sodio alcalino. Después, la microplaca se colocó dentro del lector y se dejó reposar durante 1 min, transcurrido este tiempo se hizo una agitación orbital rápida durante 5 min. Por último se realizó la lectura de absorbancia a una longitud de onda de 540 nm. Las concentraciones de proteína se expresaron en mg/mL y con base en estos resultados se calculó la pureza del aislado de proteína de cáñamo. Estas determinaciones se realizaron por triplicado.
43 Determinación de la pureza de la proteína aislada de cáñamo por cocientes de absorbancia. Se prepararon seis estándares de 38.25, 46.75, 55.25, 63.75, 72.25 y 85% de caseína al combinar caseína al 85% en diferentes proporciones con goma arábiga. La muestra de proteína de chícharo al 80% comercial se utilizó como control. Todas las mezclas se homogenizaron en un vórtex durante 1 min. Posteriormente, se obtuvieron sus espectros en un espectrofotómetro de FTIR- ATR. Los espectros fueron adquiridos con 64 barridos con una resolución de 4 cm-1 en una ventana espectral de 4,000-400 cm-1 utilizando el programa OPUS versión 7.2. A través de la intensidad de dos bandas características de la proteína (1,611 cm-1) y del polisacárido (1,020 cm-
1) se calcularon los cocientes de absorbancia para la construcción del modelo de calibración de acuerdo a la ecuación siguiente:
𝐶𝑜𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑠 = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑏𝑎𝑛𝑑𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑜𝑙𝑖𝑠𝑎𝑐á𝑟𝑖𝑑𝑜 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑏𝑎𝑛𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
Este cociente se correlacionó con las concentraciones correspondientes de los estándares, a partir de un modelo de regresión exponencial de orden dos. A partir de esta regresión se obtuvo la ecuación de calibración que permitió cuantificar la proteína en la muestra y el control. Estas determinaciones se realizaron por triplicado.