Pruebas antimicrobiales

Para el estudio de la actividad antimicrobial, se seleccionaron sólo aquellos nanocompuestos con una buena dispersión, distribución y diámetros de nanopartícula entre los 20 y 60 nm.

Además, también se estudio la actividad antimicrobial de los nanocompuestos preparados mediante mezclado en fundido. Los análisis antimicrobiales fueron realizados en el Laboratorio de Investigación Clínica de la Universidad Autónoma de Coahuila.

5.6.7.1. Material y Equipo para análisis antimicrobiales Equipo:

 Campana de flujo laminar VECO (Serial 5443 )

 Espectrofotómetro SPECTRONIC GENESYS 336001 (Serial 3V09275006)

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 Agitador Vortex (Serial 3214E )

 Autoclave JORSAN HGEC6610 (Serial 319PSS)

 Incubadora de Laboratorio (Serial 026010832).

Materiales:

 Agar Dextrosa Sabouraud (MCD LAB. L70310C037)

 Agar MacConkey (MCD LAB. L71110A074).

 Agar Sal y Manitol (BIOXON )

 Sol. Buffer BASO4 pH 6.86 ± 0.02 (L10021376).

 Cultivos frescos de 18-24 horas en medio sólido de Aspergillus niger, Escherichia coli y Staphylococcus aureus..

 Placas de agar específico para cada microorganismo, con un espesor de 4 mm (24 ml de medio en placas de Petri de 90 mm de diámetro).

 Tubos con solución salina (0.85-.9 % NaCl) estéril.

 Pipetas Pasteur estériles.

 Tubos con estándar de McFarland 0.5.

 Asa bacteriológica.

 Regla milimétrica.

5.6.7.2. Análisis cualitativo

Se utilizó el método de difusión en agar para la determinación cualitativa de la actividad antimicrobiana de los nanocompuestos de ABS/Ag. El método de difusión en agar consistió en colocar el material antimicrobiano directamente en la superficie del agar. Al contacto con el agar, el agente antimicrobiano se difundió fuera de la muestra. Después de transcurrido el período de incubación, se midió el diámetro de la zona de inhibición alrededor de las muestras. El tamaño de la zona de inhibición es inversamente proporcional a la concentración mínima inhibitoria (CMI.) A continuación se describe el procedimiento empleado para la preparación de los inóculos de Aspergillus niger, Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

52 Aspergillus niger

A partir de un cultivo fresco (18-24 Horas) en placa, se tomaron con asa cultivo, 5 UFC en un tubo con solución salina estéril 0.9%, se incubaron a 35^o C durante 2 horas. La turbidez se ajusto con BaSO₄ hasta una escala 0.5 de McFarland. La densidad del inóculo se verificó mediante un espectrofotómetro a una longitud de onda de 625 nm y una absorbancia de entre 0.8 y 0.10. De esta forma, se obtuvo una suspensión de 1.5 UFC/ml. Se prepararon 6 alícuotas de la muestra. Esta suspensión se utilizó en los primeros 15-30 minutos, para la preparación de las placas de cultivo. Mediante un hisopo de algodón estéril, se tomó la muestra, retirando el exceso de líquido al presionar contra las paredes del tubo.

En una base de agar Dextrosa Sabouraud con un pH de 5.6 ± 0.2, preparado de acuerdo al estándar del fabricante, y esterilizado a 121 ºC a 15 libras, colocado en cajas Petri e incubado durante 24 horas previas a la siembra para control de calidad, se realizó la siembra de la muestra mediante el método de estriado. Se incubó en una temperatura de 35-37 ºC durante 24 horas, después de las cuales se colocó en cada caja de Petri con el hongo, cada una de las muestras tratadas y el banco correspondiente. El diámetro de inhibición se midió con una regla milimétrica al milímetro más cercano.

Escherichia coli

Con pocas excepciones, el procedimiento que se siguió para preparar el inóculo de E. Coli fue el mismo al que se empleó para preparar A. Niger. Para la bacteria E. Coli, se utilizó un agar MacConkey, una temperatura de incubación de 37 ºC y una humedad relativa de 90%. Las lecturas y los cálculos se realizaron también mediante la misma metodología.

Staphylococcus aureus

En una base de agar de Sal y Manitol se realizó la misma metodología, excepto que este microorganismo se incubó a una temperatura constante de 37 ºC y una humedad relativa de 90%. Las lecturas y los cálculos se realizaron mediante la misma metodología.

5.6.7.3. Análisis cuantitativo

Para la determinación del porciento de inhibición de los microorganismos, se empleó el método de suspensión cuantitativa por dilución y conteo. Este método consistió en determinar cuantitativamente la concentración de los microorganismos antes y después de la exposición

53 al agente antimicrobiano. La concentración de los microorganismos se midió en unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml.) El porcentaje de inhibición del micro- organismo se calculó en base a la siguiente ecuación.

%𝐼 = 𝐵 − 𝐴

𝐵 𝑋100 ………... Ecuación 5.1

% I = Porcentaje de inhibición

A = Promedio UFC viables en muestras tratadas

B = Promedio UFC viables en muestras control o blancos.

Para la determinación del crecimiento bacteriano por el método de suspensión cuantitativa por dilución y conteo, se utilizaron los tubos que contenían solución de NaCl al 0.9% con el inóculo bacteriano, se agitaron en agitador vortex durante 2 h a 37 ºC.

La concentración del inóculo se controló al realizar diluciones decimales seriadas 1:10 y sembrar 0.1 ml de las diluciones 10^-4, 10^-5, 10^-6 en una placa de agar Dextrosa Sabouraud para cada una de las 6 muestras. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 24 h. Todos los inóculos se utilizaron dentro de la primera hora de preparados y se consideraron válidos los conteos entre 20 y 200 UFC/ml.

Se tomó una alícuota de 10 ml de cada tubo, se realizaron diluciones seriadas en solución salina 1/10 (hasta 10^-6), y se sembró en placas de agar Dextrosa Sabouraud. Después de 24 h de incubación a 37 ºC, se contaron las colonias y las unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml), a partir del conteo de colonias y la dilución respectiva.

5.6.7.3. Cinética de inhibición de A. Niger.

1. Se colocaron 2.5 g del polvo en 100 ml de agua destilada y se mezcló perfectamente.

2. Se esterilizó el medio a 121ºC por 15 minutos.

3. Inmediatamente después de esterilizar en autoclave, se dejo enfriar.

4. Se inoculó con 1.0 ml de la suspensión de esporas del hongo A. Niger y se mantuvo a 37 ºC a una velocidad de agitación de 100 rpm durante tiempos de 24, 48 y 72 horas.

54 5. Al finalizar el período de crecimiento, el caldo de cultivo se separó por filtración obteniendo la biomasa micelar y el filtrado. Posteriormente, se reportó la biomasa micelar en peso seco.

Se calculó el porcentaje de inhibición de acuerdo a la ecuación 5.1. Donde: B es el peso de la biomasa para la muestra de referencia (sin recubrimiento de nanopartícula de plata) y A es el peso de la biomasa para el nanocompuesto estudiado. La biomasa se reporta en peso seco.

Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

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