PURIFICACIÓN PARCIAL DE LA HIDROLASA

3.2.4 PURIFICACIÓN PARCIAL DE LA HIDROLASA RESPONSABLE DE LA

600 kDa). La elución se realizó con un gradiente isocrático de 150 mM de NaCl en MOPS 2.5 mM, pH 7.2 en 1.5 volúmenes de columna a un flujo de 1 mL/min con ayuda de un FPLC marca GE modelo AKTA PRIME. La salida se colectó en fracciones de 1 mL y se determinó actividad Fae sobre MpC. Las fracciones con mayor actividad específica se mezclaron y concentraron con una unidad de ultrafiltración de 15 mL de 3 kDa de corte y se diafiltraron con tampón MOPS 2.5 mM a pH 7.2. Finalmente la muestra se almacenó en alícuotas de 50

L a -20°C.

3.2.5 SÍNTESIS DE BUTIL HIDROXICINAMATOS VÍA ALCOHÓLISIS DE METIL HIDROXICINAMATOS.

3.2.5.1 Síntesis de butil hidroxicinamatos utilizando biocatalizadores inmovilizados.

En un vial de reacción ámbar de 4 mL se colocaron 2 mL de una solución de metil hidroxicinamato 50 mM y butanol 75 mM concentración final en la mezcla de reacción (0.54%, v/v) en isooctano, con 100 mg/mL de cada biocatalizador (bagazos secos obtenidos de las fermentaciones sólidas, inmovilizados de CALB, RML y TLL), la mezcla de reacción se mantuvo a 50°C y 1000 RPM durante 120 h. El curso de la reacción se monitoreó cada 24 h cualitativamente por CCF (ver sección 3.2.3.2) y la velocidad inicial de síntesis se cuantificó por cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía de capa fina de alto rendimiento (CCFAR).

Determinación cuantitativa de la velocidad inicial de síntesis por 3.2.5.1.1

cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).

El análisis cuantitativo de las reacciones de síntesis se realizó vía HPLC. El equipo empleado esta compuesto de un automuestreador, bombas, horno, detector UV marca VARIAN y el sistema operativo Galaxie®. Se empleó una columna Luna® 5 µm Silica (2) 100 Å, 150 x 4.6 mm de PHENOMENEX®. Como fase móvil se empleó una mezcla de hexano: acetato de etilo en relación 80:20 (v:v) filtrada con una membrana de nylon 0.45 m en un equipo de filtración Millipore® de vidrio y se desgasificó. Las muestras se prepararon llevando 20 L de mezcla de reacción a 200 L con acetato de etilo, posteriormente se filtraron utilizando

una membrana de nylon de 0.45 m y 35 mm de diámetro para jeringa marca millipore; el filtrado se depositó en un inserto agilent de 250 L de capacidad, el cual a su vez se colocó en viales Agilent de 9 mm de diámetro y 1.5 mL de capacidad. El análisis se llevó a 30°C con un flujo de 1 mL/min, y la detección de sustratos tanto como productos se realizó a 310 nm.

Efecto de solvente, temperatura y relación molar de sustratos en la 3.2.5.1.2

síntesis de butil ferulato con bagazos sólidos secos provenientes de la FMS.

Para evaluar el efecto del solvente de reacción, la temperatura y la relación molar de los sustratos se tomó como reacción modelo la síntesis del butil ferulato. La reacción se llevó a cabo como se indica en la sección 3.2.5.1. Los solventes evaluados fueron isooctano, tolueno, tert-butanol, acetonitrilo y DMSO. Una vez elegido el mejor solvente se evaluó el efecto de tres temperaturas 30, 50 y 70°C. Finalmente se evaluaron tres relaciones molares de metil ferulato y butanol (50:75, 50:50, 75:50 mM; respectivamente) en las condiciones previamente establecidas. La formación del producto se monitoreó cualitativamente por CCF y la velocidad inicial de síntesis se cuantificó por HPLC.

3.2.5.2 Síntesis de butil hidroxicinamatos utilizando biocatalizadores líquidos: Sistemas ternarios.

Las reacciones de alcohólisis de los metil hidroxicinamatos se llevaron a cabo utilizando la metodología empleada por Topakas en 2003, con ligeras modificaciones. En un microtubo ámbar de 1.5 mL se preparó una microemulsión libre de surfactante utilizando 250 L de una solución de metil hidroxicinamato 200 mM en butanol, 730 L de isooctano y se agitó hasta alcanzar homogenidad. Posteriormente se agregaron 20 L de la solución enzimática y la reacción se incubó a 30°C y 2000 RPM de agitación. Alícuotas de 20L se tomaron a los 15, 30, 60, 120 y 240 min.

Posteriormente el sistema ternario empleado se mejoró para la AocFae1 evaluando los parámetros más sensibles durante la síntesis de butil ferulato. La formación del producto en todas las condiciones evaluadas se monitoreó cualitativa y cuantitativamente por

cromatografía de capa fina y cromatografía de capa fina de alta resolución (CCFAR), respectivamente.

Determinación cuantitativa de la velocidad inicial de síntesis por 3.2.5.2.1

cromatografía de capa fina de alta resolución (CCFAR).

Con ayuda de un Linomat 5 marca CAMAG se inyectaron de 1 a 10 µ L de la muestra problema a un 1 cm de la base de una placa de sílica gel de 10x20 cm con revelador para UV.

Para la separación de los metil (sustratos) y butil hidroxicinamatos (productos) se utilizó una mezcla de hexano:acetato de etilo en relación 2:1 (v:v), como fase móvil. Una vez que la placa se migró el solvente residual se evaporó a temperatura ambiente. Posteriormente, la placa se analizó a 294 nm con un densitómetro modelo Scanner 3 marca CAMAG. La concentración (mM) del producto de síntesis se obtuvo correlacionando la DO con una curva estándar de 0 a 10 mM del butil hidroxicinamato correspondiente inyectada en la misma placa.

Efecto de la concentración de butanol en la síntesis de butil ferulato.

3.2.5.2.2

Para evaluar el efecto de la concentración del butanol durante la síntesis de butil ferulato se probaron cinco concentraciones del alcohol 0.54, 6, 12.5, 25 y 50% (v/v). La concentración del metil ferulato (MF) se fijó a 50 mM final. Para preparar la microemulsión se disolvió el MF en el butanol, la mezcla de reacción se llevó a 980 L con isooctano y se agitó en un vortex hasta lograr la homogenidad. Finalmente se agregaron 20 L de una solución enzimática en MOPS 2.5 mM, pH 7.2 con 5 U/mL de actividad sobre MpC y se incubó a 30°C y 2000 RPM de agitación. La reacción se monitoreó por CCFAR a las 3 y 6 horas de reacción.

Efecto de la concentración de agua libre en la síntesis de butil ferulato.

3.2.5.2.3

Para evaluar el efecto de la concentración del agua libre durante la síntesis de butil ferulato se probaron tres concentraciones de agua 1, 2 y 4% (v/v). Para preparar las microemulsiones se agregaron 250 L de una solución 200 mM de MF en butanol, 10 L de la solución enzimática (con 5 U/mL de actividad sobre MpC). Posteriormente se adicionaron 0, 10 y 30

L de tampón MOPS 2.5 mM a pH 7.2, las mezclas se llevaron a 1 mL con isooctano y se

agitaron vigorosamente en un vortex hasta lograr la homogenidad. Finalmente la reacción se incubó a 30°C y 2000 RPM de agitación. La reacción se monitoreó por CCFAR a las 3 y 6 horas de reacción.

Efecto de la presencia de BSA en la síntesis de butil ferulato.

3.2.5.2.4

El efecto protector del BSA sobre la AocFae1 se evaluó añadiendo a 10 L de una solución enzimática con 10 U/mL de actividad Fae sobre MpC, una solución de BSA a 100 mg/mL en MOPS 2.5 mM, pH 7.2. La solución se añadió a la microemulsión generada tal como se indica en la sección 3.2.5.2 y fue llevada a cabo en las mismas condiciones señaladas. La reacción se monitoreó por CCFAR a las 3 y 6 horas de reacción.

Efecto del pH aparente de la microemulsión en la síntesis de butil ferulato.

3.2.5.2.5

Para evaluar el efecto del pH aparente durante la síntesis de butil ferulato se probaron seis diferentes pHs (Tabla 5). Para preparar las microemulsiones se agregaron 250 L de una solución 200 mM de MF en butanol y 730L de isooctano. Posteriormente se adicionaron 10

L la solución enzimática (con 10 U/mL de actividad sobre MpC) y 10 L de una solución de BSA 100 mg/mL en tampón a 50 mM al pH deseado, las mezclas se agitaron vigorosamente en un vortex hasta lograr la homogenidad. Finalmente, la reacción se incubó a 30°C y 2000 RPM de agitación. La reacción se analizó a las 3 y 6 h de progreso mediante CCFAR.

Tabla 5. Soluciones tampón utilizadas para la evaluación del pH óptimo de la AocFae1 en la síntesis de butil ferulato.

pH Tampón utilizado (50 mM)

4 Ácido Cítrico/citrato de sodio 5 Ácido. Cítrico/citrato de sodio

6 MES/NaOH

6.5 MES/NaOH

7 MOPS/NaOH

8 Tris/HCl

9 Glicina/NaOH

Efecto de la cantidad de feruloil esterasa en la síntesis de butil ferulato.

3.2.5.2.6

Para evaluar el efecto de la cantidad de feruloil esterasa en la síntesis de butil ferulato se ensayaron cinco diferentes concentraciones. Para preparar las microemulsiones se agregaron 250L de una solución 200 mM de MF en butanol y 730 L de isooctano. Posteriormente se adicionaron 10 L de una solución enzimática con 5, 10, 20, 40 y 80 U/mL de actividad sobre MpC y 10L de una solución de BSA 100 mg/mL en tampón a tris/HCl 50 mM a pH 8.0, las mezclas se agitaron vigorosamente en un vortex hasta lograr la homogenidad.

Finalmente la reacción se incubó a 30°C y 2000 RPM de agitación. Las muestras se analizaron a las 3 y 6 h de progreso mediante CCFAR.

Caracterización de la AocFae1 en la síntesis de ésteres de ácidos 3.2.5.2.7

hidroxicinámicos.

Los mejores parámetros obtenidos en los ensayos mencionados anteriormente se utilizaron para realizar la caracterización en síntesis de la AocFae1 (Tabla 6). Inicialmente se evaluó la síntesis de los 4 butil hidroxicinamatos, en función de la preferencia de AocFae1 por el metil hidroxicinamato, se evaluó el efecto de la longitud de cadena del alcohol así como la isomería del grupo alcohólico del butanol y el efecto de la isomería orto, meta y para del ácido cumárico. La reacción se realizó agregando 250L de una solución 200 mM de MF en butanol y 730 L de isooctano. Posteriormente se adicionaron 10 L de una solución enzimática con 40 U/mL de actividad sobre MpC y 10 L de una solución de BSA 100 mg/mL en tampón a tris/HCl 50 mM a pH 8.0, la mezcla se agitó vigorosamente en un vortex hasta lograr la homogenidad. Finalmente la reacción se incubó a 30°C y 2000 RPM de agitación. Las muestras se analizaron a las 0, 15, 30, 60, 120 y 240 min por HPLC (ver sección 3.2.5.1.1).

Tabla 6. Composición de las microemulsiones utilizadas para la síntesis de los ésteres de ácidos hidroxicinámicos.

Productos de

síntesis Alcohol Metil éster

Butil sinapinato Butanol Sinapinato

Butil ferulato Butanol Ferulato

Butil p-cumarato Butanol p-Cumarato

Butil cafeato Butanol Cafeato

Etil Ferulato Etanol Ferulato

Propil ferulato Propanol Ferulato

Butil Ferulato Butanol Ferulato

Octil ferulato Octanol Ferulato

Dodecil ferulato Dodecanol Ferulato

n-butil ferulato n-Butanol Ferulato

sec-butil ferulato sec-Butanol Ferulato tert-butil ferulato tert-Butanol Ferulato

Butil o-cumarato Butanol o-Cumarato

Butil m-cumarato Butanol m-Cumarato

Butil p-cumarato Butanol p-Cumarato

Concentración de metil éster a 50 mM y alcoholes al 25%.

3.2.6 SÍNTESIS DE DIPROPIONIL LUTEÍNA CON LA AocFae1.

Para realizar la síntesis de DPL, se utilizó el sistema de reacción reportado por Mateos y col [21]. En un vial de reacción ámbar de 4 mL se colocó luteína 10 mM y vinil propionato 100 mM en hexano, con 100 mg/mL de catalizador y se calentó a 50°C con agitación magnética a 1000 RPM durante un plazo de 144 h. La formación del producto se monitoreó cada 24 h utilizando CCF utilizando como fase móvil una mezcla de éter de petróleo: éter etílico en relación 1:1 (v:v).

PRODUCCIÓN PREFERENCIAL CAPÍTULO 4:

DE LAS LIPASAS Y ÉSTERESAS DE Aspergillus

ochraceus UTILIZANDO RESIDUOS DEL MAÍZ.

4.1 INTRODUCCIÓN.

La gran mayoría de los metabolitos primarios y secundarios son actualmente obtenidos por fermentación sumergida (Fs), debido a las ventajas que representa el uso de reactores en este tipo de fermentación, como homogenidad en temperatura, pH, concentración de sustratos, entre otras. No obstante, la fermentación en medio sólido (FMS) ha empezado a tener un gran auge, ya que hace posible utilizar residuos agroindustriales económicos, como soporte, inductor o ambos, reduciendo notablemente los costos de producción [98].

LA Fs y FMS han sido ampliamente socorridas para la producción de enzimas. Entre los microorganismos más utilizados para la producción de enzimas extracelulares se encuentran los hongos del género Rhizomucor, Thermomyces y Aspergillus, con los cuales se produce del 80 al 85% de enzimas comerciales en el mercado [157]. Sin embargo, se ha demostrado que bajo condiciones de FMS se puede maximizar la producción volumétrica de algunas, como las amilasas [158], fructosil transferasas [159], pectinasas [160], lipasas [161] y feruloil esterasas (Faes) [95].

Las lipasas y esterasas de Aspergillus ochraceus son enzimas de particular interés, ya que han demostrado su capacidad de realizar la síntesis de productos de alto valor agregado [22, 152]. Estudios previos han demostrado que el uso de residuos, como el salvado de trigo o mazorcas de maíz, pueden ser utilizados para la producción de Faes en Fusarium oxysporum en FMS [79] y residuos como el licor de maíz, puede inducir la producción de lipasas en el modelo Rhizpous homothallicus [91]. Lo que sugiere que la inducción de las Faes y lipasas de A. ochraceus puede ser posible a través del uso de residuos del maíz.

En la siguiente sección, se utilizaron residuos del maíz para la producción las actividades de interés con A. ochraceus. Primero se describen la elección entre dos estrategias fermentativas (líquida y sólida) para producir fermentos enriquecidos en actividad Fae, para posteriormente producir las enzimas de interés de manera preferencial empleando distintos subproductos del maíz como inductores. Lo anterior como una estrategia para generar biocatalizadores que permitan dilucidar que hidrolasa es la responsable de las reacciones de síntesis. Finalmente se evaluaron algunos parámetros como temperatura, solvente, etc., para mejorar la conversión de los productos de interés.

4.2 ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA PRODUCCIÓN DE FAES DE Aspergillus ochraceusPOR Fs Y FMS.

A través de estrategias fermentativas como la Fs y la FMS se evaluó la producción de las Faes expresadas por A. ochraceus (Aoc) y de este modo obtener la mayor actividad enzimática. Así mismo, se evaluaron las ventajas y desventajas de cada sistema con este hongo filamentoso y así establecer la estrategia fermentativa para las etapas posteriores de éste trabajo.

En la Figura 26 se muestra la cinética de actividad feruloil esterasa producida con ambos sistemas. Al emplear la Fs se observó que las actividades sobre metil p-cumarato (MpC) y ferulato (MF) incrementaron gradualmente hasta 37.96 y 79.48 mU/mL (Figura 26, líneas punteadas). Cabe resaltar que dichas actividades se alcanzaron hasta las 180 h de fermentación, sin observarse un declive en la actividad, lo que sugiere que tiempos más largos de fermentación pueden incrementar la producción. La detección de la actividad feruloil esterasa en tiempos largos de fermentación ya se ha reportado para el caso Humicola grisea en donde la actividad pudo ser cuantificable a partir de las 72 h de cultivo y el máximo de actividad se observó hasta las 192 h (470 mU/mL). Sin embargo en este último caso la actividad Fae fue de 5 a 12.3 mayor a la reportada en este trabajo para Aoc.

Figura 26. Cinéticas de actividad feruloil esterasa producidas por fermentación en medio sumergido (Fs) y fermentación en medio sólido (FMS). Las líneas punteadas indican la producción de la actividad Fae de Aspergillus ochraceus por Fs en mU/mL, mientras que las líneas continuas indican la producción alcanzada por FMS en mU/gms. La actividad feruloil esterasa se determinó sobre metil ferulato (Naranja) y metil p-cumarato (verde) a 30°C y pH 7.2.

0 500 1,000 1,500 2,000 2,500

0 50 100 150 200

Tiempo (h)

Fs MF Fs MpC FMS MF FMS MpC

Actividad Fae (Fs:mU/mL; FMS: mU/gms)

Por otra parte, en el cultivo realizado por FMS, la actividad feruloil esterasa mostró la actividad máxima con ambos sustratos a las 48 horas de fermentación (MF: 1,572.1 y MpC:

2,533.6 mU/gms) (Figura 26, líneas contínuas) y posteriormente decae de forma gradual. Lo anterior posiblemente a causa de la producción de proteasas, como lo reportó Ramirez y col [20]. Además en la FMS, la hidrólisis de MpC es 1.6 veces mayor que sobre MF, contrario a lo observado en Fs, donde la actividad sobre MpC, es el 0.48 de la actividad sobre MF. Estos resultados sugieren la producción de más de una Fae en este sistema fermentativo. Asther y col. observaron este mismo comportamiento [95] comparando la producción de la actividad Fae en sistemas fermentativos líquido y sólido; ya que observaron que el cociente de actividades MpC/MF fue de 2.4 en FMS y sólo de 0.5 en Fs en los fermentos de Aspergillus niger. Los autores atribuyeron el cambio de perfil a la presencia de dos diferentes feruloil esterasas.

Del mismo modo, la productividad volumétrica obtenida con el sistema en medio sólido fue de 100 a 335 veces mayor (43.95 y 70.84 mU/cm³.h en MF y MpC) que la obtenida con su contraparte líquida (0.4415 y 0.2109 mU/cm³.h en MF y MpC). Por lo tanto, la FMS se seleccionó como sistema de fermentación para realizar las producciones posteriores de las Faes de Aoc. Resultados similares a los anteriores ya han sido reportados en la producción de distintas enzimas como lipasas, pectinasas, entre otras [160, 161]

Finalmente, para identificar la o las Faes producidas en cada uno de los sistemas fermentativos evaluados se realizaron zimogramas de actividad empleando MF como sustrato (Figura 27A, B). En el extracto enzimático obtenido por Fs fue posible identificar solamente una banda con la actividad de interés, correspondiente a la AocFae1 que reporta Romero- Borbón y col. ([151]; Figura 27A), indicando que esta Fae es responsable de la actividad sobre los dos sustratos empleados en la Figura 26 (líneas punteadas). Esto sugiere que dicha Fae posee una ligera preferencia sobre MF. Por otra parte, con la FMS fue posible producir una Fae (AocFae2) además de la producida por Fs, la cual se produjo mayoritariamente a las 48 h y presumiblemente tenga una preferencia sobre MpC (Figura 27B). Lo anterior confirma la hipótesis de que la preferencia por hidrolizar distintos metil hidroxicinamatos en ambos sistemas fermentativos analizados anteriormente es resultado de la expresión de distintas Faes en función del sistema fermentativo empleado. Además producir las Faes por

FMS permite reducir los tiempos de cultivo, por ejemplo la AocFae1se produjo en un tiempo 7.5 veces menor por FMS que por Fs.

Figura 27. Zimogramas de las cinéticas de producción de Faes por Fs y FMS. A: Cinética de producción por Fs monitoreada a las 24, 48, 72, 96 y 180 h. B: Cinética de producción por Fs monitoreada a las 24, 48, 72, 96 y 120 h. BF: Tampón de extracción. LP: Lipasa de Thermomyces lanuginosus como testigo negativo. 002:

Extracto comercial con actividad Fae como testigo positivo. Los zimogramas se revelaron empleando como sustrato el MF a temperatura ambiente.

Cabe resaltar que una de las ventajas más sobresalientes de emplear la FMS como sistema fermentativo, es que permite utilizar los fermentos como biocatalizadores (“Whole-cell

biocatalysts”) con tan sólo un tratamiento sencillo de secado, y así inferir cual de las Faes o lipasas de Aoc es la responsable de llevar a cabo las reacciones de síntesis anteriormente mencionadas.

4.3 INDUCCIÓN PREFERENCIAL DE LAS DISTINTAS CARBOXIL ÉSTER HIDROLASAS DEAoc.

A continuación se describen las estrategias empleadas para producir biocatalizadores enriquecidos en actividad lipasa y feruloil esterasa con Aoc induciendo con residuos de maíz, como de cascarillas de diferentes variedades y fracciones de nejayote (ver sección 3.2.1).

4.3.1 CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE LOS BIOCATALIZADORES ENRIQUECIDOS EMPLEANDO CASCARILLAS DE MAÍZ.

Con el objetivo de encontrar una estrategia para producir biocatalizadores enriquecidos en cada una de las Faes de Aoc, se decidió evaluar el efecto de las cuatro combinaciones posibles inóculo/fermentación con las dos variedades de cascarillas de maíz, debido a que en

trabajos previos se observó que el cambio de la materia prima utilizada en el inóculo, podía repercutir en la expresión de las enzimas durante la fermentación (Tabla 7).

Tabla 7. Diseño de las combinaciones inóculo/fermentación con dos variedades de cascarillas de maíz.

Combinación Inóculo Fermentación

1 Blanco Amarillo

2 Blanco Blanco

3 Amarillo Amarillo

4 Amarillo Blanco

En la Figura 28 se muestran las cinéticas de actividad Fae y lipasa producidas por FMS de acuerdo a la estrategia planteada anteriormente. En los ensayos realizados, no se observó una relación directa entre la producción de actividad Feruloil esterasa y lipasa.

Al emplear la cascarilla de maíz como inductor se obtiene mayor actividad lipasa que Fae independientemente de la variedad que se use. Esto posiblemente sea resultado de cierta cantidad residual de grasa en ambas cascarillas.

La combinación 1 mostró la mayor actividad lipasa y feruloil esterasa a las 24 horas (9145 y 2034 mU/gms; Figura 28 A) y se obtuvo hasta 4.5 veces menor actividad feruloil esterasa. A las 96 horas se observó un segundo máximo sobre la actividad en TC8, lo que puede sugerir la presencia de dos enzimas con actividad lipasa. Con respecto a la actividad Fae, decayó gradualmente hasta las 120 horas de fermentación.