2. Procedimiento y método
2.3 Sistemas de fermentación
Las fermentaciones se llevaron a cabo en dos sistemas de fermentación: matraz y biorreactor. La selección del sistema dependió de la naturaleza de la prueba a realizar y del diseño experimental planteado.
Los inóculos empleados se calcularon para alcanzar una densidad celular inicial de 3.5 x 106 cel/mL en cultivo puro y en cultivo mixto se utilizó una relación 1:1 de cada cepa para obtener la concentración inicial deseada (es decir 1.75 x106 cel/mL de cada cepa de levadura).
2.3.1 Cultivo por lote
En cultivo por lote las fermentaciones se efectuaron a nivel matraz y biorreactor dependiendo del experimento. En matraz se realizaron las fermentaciones de aquellos diseños experimentales en los que se requerían de varias unidades experimentales, considerando la repetición de cada una de éstas, como por ejemplo para la selección de las levaduras en cultivo puro y mixto (Figura 2.4-A).
Para llevar a cabo las fermentaciones, se emplearon matraces Erlenmeyer con capacidad de 500 mL que contenían 250 mL de medio de cultivo. Se sellaron con tapones de algodón para permitir la entrada de oxígeno al medio y la salida de dióxido de carbono que se producía durante la fermentación. En biorreactor se efectuaron las fermentaciones de los diseños experimentales en los que se requería la obtención de mosto para destilar y caracterizar aromáticamente. Para efectuar las fermentaciones se utilizó un biorreactor New Brunswick de 14 L con un volumen de operación de 10 L. La temperatura y la velocidad de agitación fueron controladas por el mismo sistema (Figura 2.4-B). Los matraces y biorreactores se esterilizaron y después se enfriaron a 20 °C para inocularlos e iniciar las cinéticas de fermentación respectivas. Los cultivos se incubaron a 30 °C y 250 rpm durante 72 h. Estas condiciones se fijaron con ayuda de una incubadora con agitación orbital y un árbol mecánico. En todas las fermentaciones, el pH fue monitoreado pero no se controló su valor. Durante la operación en lote, únicamente se permitió la salida del dióxido de carbono producido durante la fermentación.
Figura 2.4 Matraces (A) y Biorreactor New Brunswick de 14 L (B) empleados en las fermentaciones por lote
2.3.2. Cultivo en continuo
Las fermentaciones en continuo se realizaron en un sistema Applikon (Applikon, Holanda) de 3 L con un volumen de operación de 1.5 L (Figura 2.5). El Biorreactor consiste de un recipiente de vidrio con fondo redondo y una tapa, árbol mecánico de agitación con impulsores tipo Rushton y mamparas de acero inoxidable. El Biorreactor de 3L se conectó a un panel de Bioconsola ADI 1035 y a un Biocontrolador ADI 1030 con el cual se monitoreó el pH y se controló la temperatura y la velocidad de agitación (Figura 2.5). El pH se monitoreó con un potenciómetro conectado a una sonda, la temperatura se monitoreó con un termopar conectado a otra sonda. Al inicio, el cultivo mixto se operó por lote y al llegar las levaduras a la fase de desaceleración, comenzó la alimentación del cultivo. Las fermentaciones se realizaron con ó sin suministro de oxígeno.
Cuando se empleó flujo de aire, el sistema de aireación consistió de un dispersor de gas situado al final del eje del árbol de agitación. El dispersor procura que el gas se distribuya como burbujas pequeñas, aumentando la superficie de contacto entre la fase gas y el medio de cultivo distribuyéndose lo mejor posible en el medio de cultivo. El flujo de aire a la entrada del
biorreactor fue proporcionado por una bomba peristáltica (Cole-Parmer Company, Barrington IL, EUA) sincronizada con la ayuda de un rotámetro.
Para realizar el cultivo en continuo se acoplaron dos bombas peristálticas: una que regulaba la entrada del flujo del medio de alimentación al biorreactor y otra que regulaba la salida de mosto fermentado. Ambos flujos fueron ajustados al mismo valor para mantener un volumen constante de mosto en el fermentador. El flujo de entrada, se calibró y sincronizó meticulosamente con una bomba peristáltica de caudal variable (Cole-Parmer Company, Barrington IL, EUA) con la que se adicionó continuamente medio fresco al Biorreactor. Para mantener el volumen constante, se retiró mosto con la acción de un sensor de nivel que al cerrar el circuito eléctrico con el mosto, activaba una bomba peristáltica que retiraba el mosto excedente, así se mantenía el volumen en el valor deseado (Figura 2.5). El valor del flujo de entrada dependió de la tasa de dilución probada.
El jugo del medio de entrada se preparó en contenedores de 10 L, los cuales fueron esterilizados.
El mosto retirado del fermentador se acumuló en un contendor de 1L sellado (Figura 2.6).
Figura 2.5 Biorreactor Applikon de 3 L conectado a una Bioconsola ADI 1035 utilizado en las fermentaciones en continuo.
Figura 2.6 Cultivo continuo empleado en las fermentaciones en cultivo mixto.
2.4 Métodos Analíticos.
2.4.1 Análisis de biomasa y viabilidad celular.
La cuantificación de la biomasa de las levaduras del género Saccharomyces y Kloeckera en los cultivos puros y mixtos tanto en los sistemas por lote y en continuo, se analizó por tres métodos:
2.4.1.1 Población Celular.
Para la cuantificación de levaduras se empleó una cámara de Neubauer. La cámara está dividida en tres partes: dos laterales y una central.
La parte central es más baja que las dos laterales y cuenta con una cuadrícula de 1mm2 dividida en 400 pequeños cuadros de 1/20 mm de lado. Estos 400 cuadros están agrupados en 25 cuadros grandes (Figura 2.7).
Figura 2.7 Cámara de Neubauer y microscopio empleados.
Sobre la cámara se coloca un cubreobjetos dejando un espacio de 1 mm por el cual se coloca una pequeña cantidad de muestra en la cámara con una micropipeta, la muestra entra a la cámara por medio de capilaridad, posteriormente se hace una lectura en el microscopio (Olympus CH-2 modelo CHS) con el objetivo de 40X y se hace la lectura de la cantidad de células presentes en cada cuadro. Con fines estadísticos, sólo se cuentan los cuadros que se encuentran en los extremos de las esquinas y el del centro; teniendo de esta manera un total de diez cuadros. Para garantizar un adecuado conteo celular con la cámara, se consideró que cuando había más de 30 células en cada cuadro de la cámara, se debería diluir la muestra.
La concentración de células por mililitro se determina con la siguiente ecuación:
X = N!
N!× D × 0.25 x 10!
Donde:
X = Millones de células por mililitro NC = Número de células contadas NK = Número de cuadros contados D = Dilución de la muestra
2.4.1.2 Peso Seco
La determinación de biomasa consiste en centrifugar las muestras a una velocidad de 10,000 rpm durante 15 min, en una centrífuga SOLBAT C–600 (Figura 2.8); el sobrenadante se utiliza para realizar los análisis de azúcares, compuestos volátiles y etanol, mientras que el precipitado se lava con agua destilada y se centrifuga dos veces a una velocidad de 10,000 rpm durante un tiempo de 15 minutos. A continuación se coloca la pastilla obtenida resuspendida en 5 mL de agua destilada en un recipiente de plástico previamente secado y pesado, misma que se coloca en una estufa a una temperatura de 51°C durante 24 horas. Finalmente el recipiente de plástico se deja enfriar en un desecador y se pesa con la muestra seca (es importante el uso de pinzas para el manejo de los vasos, para que de esta forma se evite la variación del peso). Con la diferencia de peso se determina la biomasa generada en gL-1.
Figura 2.8 Centrifuga SOLBAT C- 600
Para cuantificar la biomasa producida durante la fermentación, fue necesario restar el peso inicial de sólidos totales del jugo de agave, al peso de sólidos contenidos en él durante la fermentación, de tal manera que la concentración de biomasa en gL-1 se determina con la siguiente ecuación:
X = (X!−X!)−XS! V!
Donde:
X = Concentración biomasa gL-1 XF = Peso final con muestra (g) Xo = Peso inicial sin muestra (g)
XSo= Peso de sólidos totales del jugo de agave (g) Vm = Volumen de muestra (L)
2.4.1.3 Viabilidad Celular
La enumeración de levaduras se realizó por medio del método clásico de conteo en placa reportado por Pérez et al. (2000) y tomando en consideración las especificaciones de la NOM- 092-SSA1-1994. Las muestras fueron tomadas asépticamente durante de la fermentación y diluidas adecuadamente en agua destilada estéril. En cultivo puro el conteo de las levaduras se obtuvo a través del uso de medio YEPD-agar (conteniendo 20 gL-1 glucosa, 20 gL-1 de peptona, 20 gL-1 de agar y 10 gL-1 de extracto de levadura y ajustado con HCl al 50% a un pH de 4.7). En las fermentaciones en cultivo mixto, el conteo de las levaduras del género Kloeckera (K1 y K2) fue obtenida por el empleo de medio YEPD-agar adicionado con 0.5 µg/ml de cycloheximida (YEPD+CYH) (Fluka analytical) (Concentración mínima inhibitoria a la cual cesa el crecimiento de S. cerevisiae) (Tabla 2.1). El número de células viables de las levaduras Saccharomyces (S1 y S2) se estableció como la diferencia obtenida entre el número total de colonias en medio YEPD- agar y el número total de colonias en medio YEPD+CYH. Las cajas con medio YEPD-agar y YEPD+CYH fueron incubadas a 30ºC por 2 a 6 días y la cuenta se determinó hasta que no se observaron incrementos en las unidades formadoras de colonia (UFC). Adicionalmente se utilizó el medio Agar Nutriente WL (Biochemika for microbiology, composición en el ANEXO 1) para la enumeración de levaduras de las fermentación en cultivo mixto, debido a que facilita su examinación por permitir diferenciación morfológicas de las levaduras involucradas en el proceso, al pigmentarlas de dos colores diferentes, para el caso de S. cerevisiae las colonias mostraron una pigmentación blanca cremosa con forma ovalada y para K. africana las colonias mostraron una pigmentación verde intensa y un menor tamaño (Tabla 2.2, Figura 2.9 y 2.10). La concentración en unidades formadoras de colonia (UFC) por mililitro se determina con la siguiente ecuación:
X = N! V!× D
Donde:
X = UFC mL-1
NC = Número de colonias contadas en el rango de 30 a 300 Vm = Volumen de la muestra (mL)
D = Dilución de la muestra
Tabla 2.1. Concentración mínima inhibitoria de CYH en µg/mL obtenida para las levaduras K. africana (K1) y S.
cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto.
Cepa de levadura
Concentración de CYH en µg/mL
0 0.5 1 1.5 2
S1 14.5 ± 0.71 n.d n.d n.d n.d
K1 13 ± 1.41 11 ± 1.41 n.d n.d n.d
S1-K1 28 ± 2.83 11.5 ± 0.71 n.d n.d n.d
La concentración celular está dada en UFC mL-1 (106) y representa el promedio ± la desviación estándar de dos determinaciones. n.d: no crecimiento detectado.
Tabla 2.2 Concentración celular obtenida para K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto en los medios WL y YEPD.
Cepa de levadura UFC mL-1 (106)
WL YEPD
S1-CPa 6.5 ± 0.71 7.5 ± 2.12
K1-CPa 12.5 ± 2.12 11.5 ± 2.12
S1-CMa 5.5 ± 0.71 7 ± 1.41
K1-CMa 9.5 ± 0.71 9 ± 1.41
La concentración celular para S1 en cultivo mixto en medio YEPD se obtuvo de la diferencia entre el número total de colonias en medio YEPD y el número total de colonias en medio YEPD+CHY y la concentración celular de K1 en cultivo mixto en medio YEPD fue obtenida del número total de colonias en medio YEPD+CHY. Cada valor representa el promedio ± la desviación estándar de dos determinaciones. a No se encontraron diferencias significativas en la concentración celular en UFC entre las cepas en cultivo puro y mixto en medio YEPD y WL.
Figura 2.9 Crecimiento en caja en unidades formadoras de colonia (UFC) en medio WL obtenidas de las fermentaciones con S. cerevisiae (S1-A) y K. africana (K1-C) en cultivo puro (A y C) y mixto (B).
Figura 2.10 Crecimiento en caja en unidades formadoras de colonia (UFC) de los cultivos mixtos en medio YEPD (A) y medio YPD+CHY (B) de las fermentaciones con S. cerevisiae (S1-C) y K. africana (K1-D) en cultivo puro.
2.4.2 Análisis de los sustratos y productos de la fermentación
Las concentraciones de azúcares reductores y nitrógeno inorgánico presentes en el jugo de agave, y los sintetizados por las levaduras fueron analizados de acuerdo a las especificaciones que se detallan en los siguientes apartados.
2.4.2.1 Análisis de azúcares reductores.
Para la cuantificación de azúcares reductores directos (ARD) se empleó la técnica de ácido dinitrosalicílico (DNS). Para la preparación de la solución de DNS se utilizan los siguientes reactivos (Miller, 1959):
Tabla 2.3 Composición de la solución de DNS
Reactivo Peso (gr en 1 L)
Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) 10 Tartrato doble de sodio y potasio 200
Hidróxido de sodio (NaOH) 10
Metabisulfito de Sodio 0.5
Fenol 2
Preparación de la solución de DNS.
Se disuelven 10 g de hidróxido de sodio, 200 g de tartrato de sodio y potasio, 0.5 g de metabisulfito de sodio y 2 g de fenol en aproximadamente 600 mL de agua destilada, colocando un agitador magnético para asegurar la correcta homogenización de la solución; a continuación se agregan 10 g de ácido 3, 5 dinitrosalicílico, que se adiciona poco a poco (con el fin de evitar la saturación de la solución), hasta lograr su completa disolución. Finalmente, se afora a un litro con agua destilada y se almacena a 4°C en una botella ámbar para evitar su degradación por la luz.
Solución de Glucosa
La glucosa se seca previamente a una temperatura de 60°C durante 3 h y después se pasa a un desecador por 3 h. Se pesa exactamente 1 g de glucosa y se diluye en 500 mL de agua destilada, aforándose a 1000 ml.
Curva de Calibración.
De la solución de glucosa se hacen diluciones tomando alícuotas de 0, 200, 400, 600, 800 y 1000 µL en tubos de ensayo llevando luego el volumen en cada tubo a 1 mL con agua destilada. Estas soluciones tienen una concentración de 0 a 2.0 gL-1 respectivamente, a estas muestras se les determinan azúcares reductores libres.
Determinación de azúcares reductores directos.
Se colocan en tubos de ensaye 100 µL de muestra previamente diluida con 100 µL de solución DNS, se agitan y posteriormente se colocan en un baño de agua a punto de ebullición durante 5 minutos. Los tubos se enfrían en un baño de hielo por 10 minutos, para después agregar 1 mL de agua destilada y agitar. Un blanco del reactivo debe procesarse bajo el mismo procedimiento al que se someten las muestras, pero éste tendrá agua destilada en lugar de mosto. Posteriormente se agrega 100 µL de cada una de las muestras preparadas a un lector de microplacas y se lee la absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm (Figura 2.11).
Nota: La absorbancia de las muestras debe de ser menor a la máxima obtenida en la curva de calibración. Las absorbancias obtenidas en la curva de calibración, se someten a regresión lineal, a fin de obtener una ecuación que prediga la concentración de azúcares reductores directos, en una muestra de concentración desconocida. Para calcular la concentración de azúcares en las muestras de las fermentaciones, se utiliza la ecuación obtenida de la regresión, se multiplica por el factor de dilución y se obtienen las concentraciones en gramos/litro.
Figura 2.11 Espectrofotómetro y microplaca empleados para la técnica del DNS.
2.4.2.2 Análisis de amonio.
La concentración de nitrógeno inorgánico amoniacal se determinó por el método reportado por Chaney et al. (1962). En esta técnica, el catión amonio (NH4+) reacciona con el fenol y el hipoclorito presentes en la solución del reactivo, usando el nitroferrocianuro de sodio como catalizador. Esta reacción propicia la formación de compuestos tipo indofenol que aportan el color azul en un medio alcalino entre 10.4 < pH < 11.5, es realizado por la reacción de los iones de amonio con el fenol y el hipoclorito en presencia de nitroferrocianuro de sodio como catalizador. La intensidad de esa coloración es proporcional a la cantidad de nitrógeno amoniacal en la muestra.
Protocolo:
Se tomaron 20 µl de muestra previamente diluida para garantizar que se encuentre dentro del rango de la gama patrón. Se agregó 1 ml de coloreado de fenol, se agitó girando el tubo horizontalmente. Inmediatamente después se adiciona 1 ml de hipoclorito alcalino, se agitó horizontalmente y se dejó reposar 10 minutos. A continuación se agrega 8 ml de agua destilada.
Las mediciones se efectuaron en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 630 nm. Los valores de absorbancia se compararon contra una curva patrón que comprende el rango de 0 a 1.0 gL-1 de sulfato de amonio.
El reactivo del coloreado de fenol se prepara de la siguiente forma: se disuelve 25 g de fenol en 400 ml de agua destilada. Al mismo tiempo por separado se disuelve 125 mg de nitroferrocianuro de sodio en 50 ml de agua destilada y se añade a la solución de fenol, posteriormente se afora a 500 ml. Asimismo se prepara una solución de hipoclorito alcalino disolviendo 12.5 g de NaOH en 400 ml de agua destilada, posteriormente se añade 20 ml de cloro comercial y se afora a 500 ml con agua destilada.
2.4.3 Análisis de etanol
La concentración de etanol presente en el mosto fermentado se determinó con la ayuda de un equipo YSI modelo 2700 Select (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, Ohio), el cual mide su concentración con un biosensor que contiene una enzima inmovilizada (Figura 2.12).
Este biosensor contiene tres membranas. La primera es una membrana porosa de policarbonato, su función es limitar la difusión del sustrato hacia la segunda membrana. La segunda membrana contiene la enzima etanol oxidasa. La tercera membrana está compuesta por acetato de celulosa, la cual permite sólo el paso de moléculas pequeñas, tales como el peróxido de hidrógeno, y con ello elimina muchos compuestos electroquímicamente activos, que puedan afectar la medición.
Figura 2.12 Equipo YSI modelo 2700 Select empleado para la determinación de etanol
Esta técnica se basa en dos reacciones: una de oxidación y otra electroquímica. La reacción de oxidación consiste en la oxidación del etanol presente en la muestra, por medio de la enzima etanol oxidasa, produciendo peróxido de hidrógeno y acetaldehído; en seguida, el peróxido de
hidrógeno pasa a través de la membrana de acetato de celulosa hacia el electrodo de platino en el cual ocurre la segunda reacción electroquímica de oxidación. La corriente generada es directamente proporcional a la cantidad de etanol inicial, ya que la corriente es directamente proporcional a la cantidad de electrones, y esta cantidad a su vez, es proporcional a la cantidad de peróxido de hidrógeno. Las reacciones que ocurren en el sistema son las siguientes:
C2H5OH + O2 H2O5 + CH3COH H2O2 2H+ + 02 + 2e-
El método seguido para el análisis de las muestras fue el siguiente: se colocó 1mL de muestra en un tubo Eppendorf a una concentración en un rango entre 0.2 y 3 gL-1. Cada 24 h de uso del equipo, se preparó y se cambió una solución estándar de etanol a 2 gL-1, para efectuar la autocalibración del equipo. A su vez, se lavó la cámara y las membranas con una solución buffer cada vez que se terminaba de usar el equipo.
2.4.4 Destilación del mosto fermentado
Con el objetivo de analizar la bebida alcohólica que se obtendría a partir de las fermentaciones de jugo de agave por lote y en continuo, los mostos fermentados, se destilaron y rectificaron en un destilador de acero inoxidable con capacidad de 6 L, ensamblado a partir de material presente en el taller del CIATEJ, el cual consistió de las siguientes partes (Figura 2.13):
a) Resistencia: Provee la energía necesaria para calentar y ebullir el líquido dentro del destilador, el cual debe contener pequeños trozos de material poroso (cerámica, cobre) para evitar sobresaltos repentinos por sobrecalentamiento.
b) Destilador: espacio de mayor tamaño donde se coloca el mosto por destilar.
c) Cabeza de destilación: lugar por donde salen los vapores de la mezcla.
d) Termómetro/Termopar: Instrumento que permite monitorear la temperatura interna del líquido durante la destilación que oscila entre los 90-94 ºC durante la primera destilación y entre 78-80 ºC durante la rectificación (segunda destilación).
e) Tubo refrigerante: permite la condensación de los vapores.
f) Entrada de agua: regula la entrada de agua al refrigerante para mantener la temperatura del líquido condensado (≈ 4 ºC).
g) Salida de agua: regula la salida de agua del refrigerante para mantener la temperatura del líquido condensado (≈ 4 ºC).
h) Salida de destilado: es el espacio de salida del refrigerante donde se recibe el destilado que puede almacenarse en un matraz o vaso de precipitado.
i) Recirculador: permite estabilizar la temperatura de manera constante dentro del refrigerante de tal manera que se permita la condensación del líquido durante la destilación.
j) Regulador de frecuencia: Regula la intensidad de corriente eléctrica suministrada a la resistencia interna del destilador (Manteniéndose entre 50-60 volts durante todo el proceso de destilación).
Las destilaciones se realizaron siguiendo el protocolo empleado en la industria tequilera: la primera fracción separada (0.5% del volumen inicial) llamada cabezas fue eliminada, mientras que la segunda fracción fue acumulada hasta que el contenido de alcohol estuviese en el rango de 25-30 % v/v. Esta segunda fracción fue nuevamente destilada, separando el 0.5% del destilado inicial (cabezas) y acumulando el destilado (cuerpo) hasta una concentración en volumen de alcohol de 55% v/v (aproximadamente).
Figura 2.13 Destilador utilizado a nivel laboratorio.