1.22 Ruido generado por fuentes externas
4.7.6 Suavizado
La relación señal-ruido en espectros Raman puede ser baja debido a las bajas intensidades del esparcimiento de una muestra a señales bajas en regiones espectrales específicas provocadas por fallas del detector. La técnica más utilizada es la propuesta por Savitzky-Golay [33]. Este método se basa en que, para un pequeño intervalo de longitudes de onda se puede ajustar un polinomio de grado adecuado. Los nuevos valores tras el ajusto son un mejor estima que los valores medidos ya que se ha eliminado parte del ruido que los afectaba. [34]
40 El cálculo de derivadas permite acentuar las diferencias existentes en los datos espectrales. Tanto la primera derivada como la segunda derivada se utilizan a menudo para el tratamiento de los datos.
Una desventaja del uso de las derivadas es que disminuyen el valor de la relación señal-ruido, por esta razón, se recomienda realizar el suavizado de la señal Raman antes de la diferenciación de datos.
4.7.7 Variación Normal Estándar (SNV)
Al utilizar espectroscopia Raman para monitorear os cambios en cualquier sustancia química real, tal como en una situación de control de procesos las pendientes de fondo pueden variar de un espectro a otro. Generalmente, nos interesa el cambio de las intensidades de las bandas y nos los cambios de las pendientes de la línea base. [34]
En la transformación SNV cada espectro es centrado y escalado dividiendo por su desviación típica, como se refleja en la siguiente ecuación:
Donde XijSNV es el elemento del espectro transformado, Xij corresponde al espectro original i a la longitud de onda m, x es la media del espectro i y Si la desviación estándar de los valores de absorbancia de cada muestra. Cada espectro tratado de esta manera tiene media 0 y varianza igual a 1 y es, por tanto, independiente de los valores originales. [35,36]
Al aplicar la transformación SNV se asume que los efectos multiplicativos de la señal son uniformes en todo el rango espectral por lo que en caso de no ser así se pueden introducir errores.
41
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Espectroscopia Raman excitación 785
Los espectros Raman con fuente de excitación de 785 nm, de las dos bacterias ATCC, sin lavado, diluidas en agua inyectable y sin nanoparticulas son mostrados en las figuras 3 y 4, estos espectros mostraron picos muy anchos y ninguno bien definido, lo cual puede ser debido a la baja cantidad de células individuales.
Figura 6. Espectros Raman sin procesar de la cepa C. Beijerinckii con dilución 1:1 y 1:100 usando en un sustrato comercial CaF2.
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
203 272 340 408 475 541 606 670 733 796 858 919 980 1040 1099 1157 1215 1272 1328 1384 1439 1493 1547 1600 1653 1705
Intensidad Raman (u.a)
Corrimiento Raman (cm-1)
C. Beijerinckii 1:1 C. Beijerinckii 1:100
42
Figura 7. Espectros Raman sin procesar de la cepa C. Pasteurianum con dilución 1:1 y 1:100 en un sustrato comercial CaF2.
Espectroscopia Raman excitación 1064
Figura 8. Espectros Raman sin procesar de la cepa C. Beijerinckii con dilución 1:1 y 1:100 en sustrato comercial Caf2.
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
203 301 397 491 584 675 765 853 940 1025 1108 1191 1272 1351 1430 1507 1583 1657 1731 1803 1874 1944 2013 2081
Intensidad Raman (u.a)
Corrimiento Raman (cm-1)
C. Pasteurianum 1:1 C. Pasteurianum 1:100
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Intensidad Raman (u.a)
Corrimiento Raman (cm-1)
C. Beijerinckii 1:1 C. Beijerinckii 1:100
43
Figura 9. Espectro Raman sin procesar de la cepa C. Pasteurianum con dilución 1:1 y 1:100 en un sustrato comercial CaF2.
Las figuras 8 y 9 muestran los espectros Raman con fuente de excitación de 1064 nm de estas mismas dos bacterias ATCC con adición de nanopartículas de plata, estos espectros aunque muestran mas picos Raman definidos la relación señal/ruido es muy baja y no es viable identificar picos característicos de las bacterias.
Microscopio Raman excitación 785 con un objetivo de 40X y un sustrato comercial Klarite.
Para la obtención de los siguientes espectros Raman se utilizó el microscopio Raman (IDRaman) Con fuente de excitación de 785 nm, y un objetivo de microscopio de 40X, asedás de un sustrato comercial (Klarite®) para inducir la técnica SERS de las mismas dos bacterias sin lavado.
El funcionamiento del método de ajuste de curva polinomial se demuestra utilizando estos espectros.
Los espectros originales, ajustados y corregidos de las dos bacterias se representan en la figuras 10 y 11. El método de ajuste produjo un buen ajuste para la autofluorescencia de fondo. La figura 12
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Intensidad Raman (u.a)
Corrimiento Raman (cm-1)
C. Pasteurianum 1:10 C. Pasteurianum 1:100
44 muestra los espectros Raman corregidos, sin la fluorescencia de fondo. En estos espectros ya es posible identificar algunos picos Raman bien definidos en el intervalo de 750-1100 cm-1
Figura 10. Corrección de la fluorescencia de fondo del espectro Raman de C. Beijerinckii 0
5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000
275 395 515 635 755 875 995 1115 1235 1355 1475 1595
Intensidad Raman (u.a.)
Corrimiento Raman (cm-1)
C. Beijerinckii Ajuste polinomio C. Beijerinckii (Sin fondo)
45
Figura 11. Corrección de la fluorescencia de fondo del espectro Raman de C. Pasteurianum.
Figura 12. Espectros Raman corregidos de las cepas Clostridium Beijerinckii y Clostridium Pasteurianum).
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000
267 387 507 627 747 867 987 1107 1227 1347 1467 1587
Intensidad Raman (u.a.)
Corrimiento Raman (cm-1)
C. Pasteurianum C. Pasteurianum (Sin fondo) Ajuste polinomio
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
267 387 507 627 747 867 987 1107 1227 1347 1467 1587
Intensidad Raman (u.a.)
Corrimiento Raman (cm-1)
C. Beijerinckii (Sin fondo) C. Pasteurianum (Sin fondo)
46 Microscopio Raman excitación 785 con un objetivo de 80X y un sustrato comercial Klarite.
En las siguientes figuras (12-14) se muestran los espectros Raman de Espectros de C. pasteurianum en 3 diferentes diluciones con lavado y colocadas sobre un sustrato comercial (Klarite®) y obtenidos con un objetivo de 80X. La figura 10 muestra los espectros Raman sin procesar de las diluciones 1:1, 1:10 y 1:100 de C. pasteurianum. Claramente se ve que la dilución 1:1 muestra picos Raman muy bien definidos de esta bacteria.
Figura 12. Espectros Raman si procesar de C. pasteurianum en 3 diferentes diluciones.
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000
200 293 386 479 572 665 758 851 944 1037 1130 1223 1316 1409 1502 1595 1688 1781 1874 1967
Intensidad Raman (u.a.)
Corrimiento Raman (cm-1)
C. Pasteurianum 1:10 C. Pasteurianum 1:100 C. Pasteurianum 1:1
47 Los espectros originales, ajustados y corregidos 1:1, 1:10 y 1:100 de la diluciones C. pasteurianum se muestran en las figura 13-15. El polinomio que mejor se ajustó a la fluorescencia de fondo fue de quinto grado. La eliminación de la línea base de fluorescencia mejoró los picos Raman como se puede ver en los espectros corregidos.
Figura 13. Corrección de la fluorescencia de fondo de la dilución 1:10 de C. pasteurianum.
0 5000 10000 15000 20000 25000
290 383 476 569 662 755 848 941 1034 1127 1220 1313 1406 1499 1592
Intensidad Raman (u.a.)
Corrimiento Raman (cm-1)
C. Pasteurianum 1:10 Ajuste polinomio C.Pasteurianum 1:10 (Sin fondo)
48 .
Figura 14. Corrección de la fluorescencia de fondo de la dilución 1:100 de C. pasteurianum.
En la figura 15 se muestra el espectro Raman corregido de la dilución 1:1 de C. pasteurianum, en este espectro se identificaron picos Raman a 390, 414, 444, 479, 663, 684, 714, 751, 791, 812, 879, 915, 964, 1002,1085, 1131, 1169, 1213, 1230, 1306, 1397, 1441, 1484, 1529 y 1567 cm-1. Algunas atribuciones tentativas de estos picos se enumeran en detalle en la Tabla 1. Las bandas coinciden con características reportadas en la literatura para células de la bacteria anaeróbica Clostridium beijerinckii [2000]. La mayoría de las bandas corresponden a grupos funcionales en los constituyentes principales de una célula microbiana, proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos.
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000
290 383 476 569 662 755 848 941 1034 1127 1220 1313 1406 1499 1592
Intensidad Raman (u.a.)
Corrimiento Raman (cm-1)
C. Pasteurianum 1:100 Ajuste polinomio C. Pasteurianum 1:100 (Sin fondo)
49
Figura 15. Corrección de la fluorescencia de fondo de la dilución 1:1 de C. pasteurianum.
Para obtener el mejor espectro para la detección de los picos Raman con mejor resolución buscaron diferentes métodos, con un objetivo de 40x a 80x y dos sustratos de dos marcas distintas Klarite y Oceanoptics. Ambos constaban de una combinación de coloides de oro y plata, para incrementar la señal Raman. Y observados en un microscopio Raman con distintos tiempos de integración y potencia de salida. Al utilizar los sustratos Klarite nos daban una mayor intensidad de alrededor de 20000 unidades arbitrarias (intensidad Raman), esto por la buena señal del sustrato y el acoplamiento de nanoparticulas de plata/oro. Los sustratos obtenidos de Oceanoptics nos daban una intensidad más pequeña de alrededor de 7000 unidad arbitrarias (intensidad Raman) lo que nos afirma que estos sustratos tienen una menor ampliación en su señal Raman, pero no se podría decir con esto, que son menos útiles para la identificación por espectroscopia Raman, pues también nos dan muchos picos o bandas Raman para identificar compuestos dentro de las bacterias Clostridium, como se puede observar en las siguientes figuras.
50 Microscopio Raman excitación 785 con un objetivo de 80X y un sustrato comercial Oceanoptics.
Figura 16. Espectro de Clostridium pasteurianum tomado con microscopio Raman en un sustrato comercial con mezcla de oro y plata de oceanoptics en diferentes puntos de la muestra los cuales muestran homogeneidad.
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
388 429 470 511 552 593 634 675 716 757 798 839 880 921 962 1003 1044 1085 1126 1167 1208 1249 1290 1331 1372 1413 1454 1495 1536 1577 1618 1659
Intensidad Raman (u.a)
corrimiento Raman (cm-1)
pasteurianum k1 pasteurianum k2 pasteurianum k3 pasteurianum k4
51
Figura 17. Espectro de Clostridium beijerinckii tomado con microscopio Raman en un sustrato comercial con mezcla de oro y plata de oceanoptics en diferentes puntos de la muestra los cuales muestran homogeneidad.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
388 430 472 514 556 598 640 682 724 766 808 850 892 934 976 1018 1060 1102 1144 1186 1228 1270 1312 1354 1396 1438 1480 1522 1564 1606 1648
intensidad Raman (u.a)
corrimiento Raman (cm-1)
C. beijerinckii 1 beijerinckii K5 C. beijerinckii 2
52 En las figuras 16 y 17 podemos observar diferentes espectros de Clostridium pasteurianum y Clostridium beijerinckii las cuales fueron tomadas en diferentes puntos de la misma muestra de las bacterias analizadas. En las dos figuras los espectros muestran los mismos picos o bandas Raman Varias bandas interesantes aparecen en el espectro. Algunas atribuciones tentativas se enumeran en detalle en la Tabla 1. Las bandas características de coincidencia informadas en la literatura para muestras de mayor tamaño cantidades de biomasa bacteriana o sus componentes moleculares (Tabla 1). La mayoría de las bandas corresponden a grupos funcionales en el principal constituyentes de una célula microbiana, proteínas, carbohidratos, lípidos, y ácidos nucleicos.
Microscopio Raman excitación 785 con un objetivo de 40X y un sustrato comercial Klarite.
Figura 18. Espectro de Clostridium pasteurianum tomado con microscopio Raman con objetivo de 40X en un sustrato comercial con mezcla de oro y plata Klarite® en diferentes puntos de la muestra los cuales muestran homogeneidad las bandas Raman.
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000
302 352 402 452 502 552 602 652 702 752 802 852 902 952 1002 1052 1102 1152 1202 1252 1302 1352 1402 1452 1502
intensidad Raman (u.a)
corrimiento Raman (cm-1)
past 80k1 past 80k2 past 80k3 past 80k4 past 80k5
53 Microscopio Raman excitación 785 con un objetivo de 80X y un sustrato comercial Klarite.
Figura 19. Espectro de Clostridium beijerinckii tomado con microscopio Raman con objetivo de 80X en un sustrato comercial con mezcla de oro y plata Klarite® en diferentes puntos de la muestra los cuales muestran homogeneidad las bandas Raman y un espectro del sustrato comercial Klarite.
En la figura 19 se muestra un espectro del sustrato comercial marca Klarite® el cual nos da el mínimo ruido, con lo que nos da una buena señal ruido, y podemos observar dos espectros de la misma bacteria C. beijerinckii tomada de dos diferentes partes de la muestra, en donde podemos observar homogeneidad en los picos Raman.
Microscopio Raman excitación 785 con un objetivo de 40X y 80X con sustrato comercial Klarite.
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
200 270 340 410 480 550 620 690 760 830 900 970 1040 1110 1180 1250 1320 1390 1460 1530 1600 1670 1740 1810 1880 1950
Intensidad raman (u.a)
numero de onda (cm-1)
C. beijerinckii 80xK C. beijerinckii 80xK 2 klarite
54
Figura 20. Espectro de Clostridium pasteurianum tomado con microscopio Raman con objetivo de 80X y un objetivo de 40 X en un sustrato comercial con mezcla de oro y plata Klarite® en diferentes puntos de la muestra los cuales muestran homogeneidad las bandas Raman en los dos diferentes objetivos.
La figura 20 nos muestra dos tipos de espectros uno tomado con un objetivo de 40X los cuales muestran homogeneidad entre ellos, las bandas o picos Raman se muestran en el mismo corrimiento, pero con una baja intensidad. En cambio los espectros tomados con un objetivo de 80X también muestran homogeneidad entre ellos pero con una mayor señal/ruido y mayor intensidad en sus bandas o picos Raman, lo cual nos dice que al aumentar el objetivo los resultados nos muestran una mejor señal.
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000
200 260 320 380 440 500 560 620 680 740 800 860 920 980 1040 1100 1160 1220 1280 1340 1400 1460 1520 1580 1640 1700 1760 1820 1880 1940 2000
intensidad Raman (u.a)
corrimiento Raman (cm-1)
Pasteurianum 80xk3 Pasteu 80xK2 Pasteu 80xk 1 pasteu 80x 1.1 pasteu 80x 0
pasteu 40x 2 pasteu 40x 0 paust 80x k5 past 40x 6
55 Microscopio Raman excitación 785 con un objetivo de 80X y un sustrato comercial Klarite.
Figura 21. Espectro de Clostridium pasteurianum tomado con microscopio Raman con objetivo de 80x (con corrección de línea base y eliminación de fluorescencia) en un sustrato comercial con mezcla de oro y plata Klarite en diferentes puntos de la muestra los cuales muestran homogeneidad las bandas Raman.
0 5000 10000 15000 20000 25000
265 310 355 400 445 490 535 580 625 670 715 760 805 850 895 940 985 1030 1075 1120 1165 1210 1255 1300 1345 1390 1435 1480 1525 1570 1615
intensidad Raman (u.a)
corrimiento Raman (cm-1)
Pasteurianum 80xk3 Pasteu 80xk 1 pasteu 80x 0 paust 80x k5
56 Figura 22. Espectros de Clostridium beijerinckii y Clostridium pasteurianum tomado con microscopio Raman con objetivo de 80X en un sustrato comercial con mezcla de oro y plata Klarite® .
Figura 23. Espectro de Clostridium beijerinckii tomado con microscopio Raman con objetivo de 80X en un sustrato comercial con mezcla de oro y plata Klarite®.
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
290 383 476 569 662 755 848 941 1034 1127 1220 1313 1406 1499 1592
Corrimiento Raman (cm-1)
Intensidad Raman (u.a)
C.beijerinckii C. pasteurianum
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
290 383 476 569 662 755 848 941 1034 1127 1220 1313 1406 1499 1592
Corrimiento Raman (cm-1)
Intensidad Raman (u.a)
C.beijerinckii
Fenilalanina 1004 Almidón
polisacárido 481
407 Carbohidratos
407
Ácidos nucleicos 778-782
Rango Carbohidratos 1030-1091
Rango Amida II Lípidos 1449-1482 Amida III
57
Figura 24. Espectro de Clostridium pasteurianum tomado con microscopio Raman con objetivo de 80X en un sustrato comercial con mezcla de oro y plata Klarite®.
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
290 383 476 569 662 755 848 941 1034 1127 1220 1313 1406 1499 1592
Corrimiento Raman (cm-1)
Intensidad Raman (u.a)
C. pasteurianum
Fenilalanina 1004
Ácidos nucleicos 1318
Amida II
1230-1295 Lípidos 1446 Carbohidratos
407
Proteína 835
Rango Carbohidratos C-C, C-O, (C-O-H) 1030-1096-1130 Almidón
polisacárido 481
407
Ácidos nucleicos 778-782
C═C 1573
Amida I 1665
58
6. CONCLUSIONES
Se probaron diferentes métodos, con espectroscopia Raman con dos fibras bifurcadas y una longitud de onda de 785 nm y 1064 nm, 400 mW y 500 mW respectivamente, con muestra liquida y seca de las dos diferentes cepas del genero Clostridium. Se agregaron nanoparticulas a las diferentes muestras, las cuales se prepararon en el laboratorio. Se utilizó también un microscopio Raman con una longitud de onda de 785 nm y una potencia máxima de 70 mW, el cual primero se puso una muestra de las células de Clostridium pasteurianum seguido de Clostridium beijerinckii por separado en un vidrio porta objetos, un vidrio de un sustrato de Caf2, y un sustrato de la marca Klarite y uno de la marca Oceanoptics. Para observar cual era el mejor material y el mejor método para el análisis mediante espectroscopia Raman.
En base a los resultados obtenidos, se puede concluir que la mejor técnica para la identificación de bacterias Clostridium pasteurianum y Clostridium beijerinckii, es la combinación de la técnica SERS con la microscopia Raman, ya que proporciona información espectral de grupos funcionales de los constituyentes principales de células microbiana, tales como, proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos.
El objetivo principal de este estudio fue para evaluar si las heterogeneidades y las distribuciones en la composición química de las células individuales de las dos diferentes cepas en un cultivo podrían ser detectadas. Para este objetivo, se analizó una muestra en la que las células se diferenciaron visiblemente (Figura 15 y 16). Algunas células todavía eran bastante pequeñas y con forma de vara;
otros fueron agrandados y habían acumulado el polisacárido de almacenamiento granulosa De hecho, algunos de los espectros mostraron el pico de granulosa característico a 481 cm-1 (espectros 1-3), mientras que otros no. En comparación, más características de la granulosa tipo almidón en células diferenciadas se puede encontrar en 941 cm-1 y en la región de 1080-1130 cm-1. En la otra mano, un
59 pico en la región de hidratos de carbono a 1050 cm-1 permanece bastante constante, lo que sugiere que este es un componente constitutivo, posiblemente desde la pared de la celda. Las células con poca o ninguna granulosa mostraron un pico de fenilalanina más alto a 1005 cm-1 y un poco más región pronunciada de amida III (1220-1290 cm-1), lo que indica un mayor contenido de proteína relativa.
Además, el pico alrededor de 1450 cm-1 (atribuido a las vibraciones de flexión de CH2, principalmente de los lípidos y aminoácidos de cadena larga) varía considerablemente en intensidad en diferentes celdas. Por lo tanto, se puede concluir que la composición química del único las células bacterianas pueden ser evaluadas por microspectroscopia Raman con la ayuda de un sustrato comercial compuesto por nanoparticulas de oro y plata, las diferencias en la composición de las células dentro de un cultivo la muestra puede ser detectada.
60 CRONOGRAMA
CUATRIMESTRE ACTIVIDAD
1 sep-dic 2015
2 ene-abr 2016
3 may-ag 2016
4 sep- dic 2016
5 ene- abr 2017
6 may-ag 2017
7 sep- dic 2017 Revisión bibliográfica
Elaboración del protocolo Desarrollo de algoritmos y correlación del método tradicional y el método óptico
Validación del método
óptico para la
caracterización de B.
anaerobias
Análisis de resultados Elaboración y envío del 1er manuscrito
Defensa de la Tesis
61 BIBLIOGRAFIA
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