Distribucions de densitat (eix d'ordenades) de velocitats angulars en rad/s (eix d'abscisses) de l'individu indicat (deformació N2), variant els valors assignats a fluència (ocre) i reorientació o bucle (blau). Distribucions de densitat (eix d'ordenades) de velocitats angulars en rad/s (eix d'abscisses) de l'individu indicat (deformació CB456) distingint els valors assignats a fluència (ocre) i reorientació o bucle (blau).
Context i justificació del treball
Els resultats obtinguts de la primera part metodològica han permès contrastar la comunitat intestinal característica de diferents tipus de nematodes, mostrant una clara influència de l'entorn de creixement dels cucs en la composició de la seva microbiota. Aquesta tàctica polifacètica inclou la pre-detecció d'aliments mitjançant la recerca i el rodatge, així com els esdeveniments posteriors d'assetjament i/o manipulació de preses [30,31].
Objectius
Identificar i descriure els principals motors del comportament d'alimentació animal segueix sent un repte notable en la branca de l'ecologia del moviment [29]. Per tant, la reacció de l'animal està influïda tant per les característiques de l'entorn (principalment espacial-temporal) com per l'aprenentatge basat en experiències prèvies i l'estat en què es troba l'individu [29,30,31].
Enfoc i mètode a seguir
Generar un pipeline bioinformàtic per determinar la composició de la microbiota intestinal de diversos nematodes, a partir de les dades de la literatura i bases de dades públiques. Informar de la distribució de la microbiota intestinal natural de les espècies avaluades i, idealment, estudiar les possibles diferències en funció de les condicions de creixement del cuc.
Planificació
Implementació d'un algorisme computacional en llenguatge R per netejar trajectòries i distingir diferents tipus de moviment. Caracteritzar taxonòmicament amb R la microbiota intestinal dels nematodes i inferir diferències estadísticament significatives en la composició microbiana de les diferents espècies o soques analitzades.
Breu sumari de contribucions i productes obtinguts
Diferenciar i segmentar els moviments de rastreig dels moviments de reorientació (girs, girs o piruetes) gràcies a l'aplicació de l'algorisme computacional.
Breu descripció dels capítols de la memòria
La microbiota intestinal de C. elegans
Tanmateix, els estudis indiquen l'existència d'una variació considerable en la comunitat bacteriana intraespecífica causada pel medi ambient i la genètica de l'hoste. Pel que fa a l'efecte de la composició de la microbiota entèrica sobre l'hoste, algunes investigacions mostren que la composició i la diversitat de la comunitat bacteriana ambiental està relacionada amb les etapes de desenvolupament dels nematodes [26,45].
Mètodes d’estudi del comportament motor dels nematodes
En general, la velocitat del nematode es defineix com la velocitat de canvi en la ubicació del seu centroide al llarg de l'esquelet en funció del temps, i es mesura sobre la seqüència de fotogrames individuals de l'enregistrament. Per tant, la caracterització diferencial de la microbiota intestinal i el moviment de diferents soques de C.
Caracterització de la microbiota intestinal del nematode C. elegans
Mètodes i procediments del meta-anàlisi
Descàrrega i descripció inicial dels datasets de seqüències
Les dades associades (identificades pel cognom de l'autor, Johnke) s'emmagatzemen a l'entrada del repositori EBI-ENA PRJEB33740. Aquest conjunt de dades (identificat pel cognom de l'autor, Samuel) es pot descarregar des de l'entrada de la base de dades NCBI-SRA SRS1849345.
Pre-processat inicial dels datasets: merging
Dit això, les lectures de seqüenciació dels conjunts de dades Berg_assembly i Samuel es van desar amb l'extensió FASTQ.gz. Les lectures de cada metagenoma es van desar amb l'extensió FASTQ.gz, separant ara les lectures aparellades en dos fitxers comprimits R1 i R2.
Pre-processat inicial dels datasets: anàlisi de qualitat
Com es pot veure, la majoria de lectures del conjunt de dades Dirksen_native tenen una longitud d'aproximadament 250 pb (figura 2A) i un índex de qualitat superior a 40 (figura 2B). Visualització gràfica generada per R de les estadístiques de qualitat associades a les lectures del metagenoma (presentada només com a exemple per al conjunt de dades Dirksen_native). A) Distribució de les longituds de lectura de seqüències (en bp); B) Distribució dels índexs de qualitat de les lectures obtingudes; c.
Pre-processat inicial dels datasets: filtratge de seqüències
La caiguda de la puntuació Q mitjana per sota de 40 és notable quan les longituds de lectura són superiors a 250 pb (Fig. 2C). Tenint això en compte, és evident que l'EE mitjà de les lectures sembla estar al voltant de 0,175 a 250 pb, i a longituds més altes hi ha un augment dràstic d'aquest valor (Fig. 2D). A més, tenint en compte qualsevol dels llindars fiables per a EE, és possible conservar més del 75% de les seqüències del conjunt de dades de 250 pb de longitud (Fig. 2E).
Val la pena assenyalar que l'anàlisi de qualitat no es va poder realitzar al metagenoma Berg_host, ja que l'ordre fastq_stats de VSEARCH només funciona amb entrada en format FASTQ i aquest conjunt de dades constava de lectures esteses per FASTA.
Pre-processat conjunt dels datasets: identificació de seqüències úniques
Pre-processat conjunt dels datasets: generació d’OTUs al 97% d’identitat
L'algoritme UPARSE està integrat al programa USEARCH [39] i permet calcular un conjunt de les OTU més representatives utilitzant un llindar d'identitat mínim del 97%, informant d'un percentatge inferior de bases falses del que s'obtindria amb altres mètodes de clustering (com ara com QIIME o mothur) [41,78]. El programari retorna un subconjunt de totes les seqüències biològicament correctes presents a les lectures i, per tant, un nombre menor d'OTU que esdevé coherent amb el valor esperat de les espècies a la comunitat d'estudi [41,75]. Tots els parells d'OTU considerats pel programari han de diferir en un 3% o més d'identitat, i els que són quimèrics es descarten [79].
Una taula d'OTU és una matriu que informa del recompte de lectures (o la seva freqüència en una escala de 0 a 1) per mostra (columnes) i per OTU (files) [81].
Pre-processat conjunt dels datasets: classificació taxonòmica dels OTUs
Anàlisi descriptiva i estadística de les dades pre-processades
Estudi i modelització computacional dels patrons motors del nematode C. elegans . 21
Cal destacar que el codi original forma part d'un projecte de tesi encara en desenvolupament de l'estudiant Roger Lloret Cabot, investigador predoctoral del CEAB-CSIC. Val la pena assenyalar que és impossible continuar enregistrant les trajectòries d'alta resolució sense manipular primer els cucs al laboratori. Fase Experimental I: Preparació de reactius i conservació d'existències de nematodes El primer pas va consistir a preparar i autoclauar les solucions necessàries per a una correcta manipulació.
Fase experimental I: preparació de reactius i preservació de stocks de
Fase experimental II: pre-cultiu d’E. coli i preparació de plaques NGM
Això és beneficiós perquè no dificulta la visualització o el desenvolupament dels nematodes, alhora que els permet aparellar-se millor i alimentar-se contínuament [87]. Passat aquest temps, es van distribuir 0,8 ml d'aquest precultiu a cadascuna de les plaques ja preparades amb agar NGM solidificat. El volum afegit es va repartir per tota la superfície, evitant a tota costa les vores de la pròpia placa de Petri, ja que era interessant disposar d'un pegat d'aliment bacterian distribuït pel mig.
Finalment, aquestes plaques NGM amb substrat es van incubar durant la nit a temperatura ambient per desenvolupar la gespa microbiana que serviria d'aliment per als futurs nematodes.
Fase experimental III: descongelació de vials i sincronització de nematodes
Generació de trajectòries individuals d’alta resolució
En aquest cas, el programa implementat amb Eclipse ja estava disponible al laboratori i es va utilitzar per parametritzar les opcions d'imatge, ajustar i calibrar la configuració de la càmera en el procés de seguiment, mesurar en temps real les expressions motrius derivades de les imatges capturades i reconstruir el trajectòries globals dels nematodes. Els fitxers de desplaçament així generats es van guardar en format .CSV per analitzar-los amb un algorisme computacional posterior, atès que contenien les dades de comportament quantificades necessàries.
Simplificació, optimització i implementació d’un pipeline bioinformàtic per a la
Descripció del perfil microbià intestinal del gènere Caenorhabditis
La figura 3 correspon a una representació NMDS de les mostres de microbioma processades finals, que s'identifiquen pel color en funció de les condicions de creixement de l'hoste d'origen. Esquema NMDS de mostres de microbioma identificades per les condicions de creixement de l'hoste. Gràfic NMDS de mostres de microbioma identificades per condició d'origen de creixement de l'hoste (Condició de creixement), després de resumir les categories i eliminar mostres de microbioma de substrat.
D'altra banda, el gràfic descriptiu de la Figura 7 ajuda a identificar les principals famílies taxonòmices descrites a les OTU, amb l'objectiu de contrastar posteriorment les mostres de microbioma dels cucs de l'espècie C.
Caracterització dels patrons de locomoció de C. elegans
D'altra banda, les distribucions de densitat de les velocitats lineals seguides per un individu de cada deformació es poden consultar a les figures 12 i 13. El gràfic de l'apartat C mostra la mateixa distribució combinada però distingeix cadascuna de les parts elementals que la formen. Distribucions de densitat de les velocitats lineals seguides per l'individu de la soca N2 de C. elegans.
Finalment, les figures 16 i 17 mostren les distribucions de densitat de les velocitats angulars (en radians per segon) per a cadascun dels organismes provats.
Variació del microbioma entèric del gènere Caenorhabditis
Això és coherent amb els resultats del diagrama de caixa múltiple de la figura 6A, en què es conclou que la dispersió associada a les mostres del medi natural és molt més gran (més distància del centre) que la de l'entorn semiartificial i experimental, malgrat els tipus de estudiar. Pel que fa als càlculs del test de Tukey (Figura 6B), es pot dir que hi ha diferències estadísticament significatives (valor p ajustat inferior a 0,001) entre totes les condicions de creixement de C. Això permet una bona traçabilitat de l'origen del nematode. , de manera que la sobrerepresentació d'algunes famílies taxonòmices pot ajudar a definir l'entorn de distribució del cuc.
De la mateixa manera, la comparació del perfil microbià característic de les 3 espècies de Caenorhabditis aïllades del medi natural (figura 8) prediu diferències significatives determinades per les espècies dels mateixos individus.
Contrast de motilitat entre diverses soques de C. elegans
En ambdós casos és cridaner el predomini de les famílies Enterobacteriaceae, Sphingomonadaceae i Pseudomonadaceae, els gèneres de les quals són comensals típics del tracte gastrointestinal de nematodes i mamífers [26, 46]. No hi ha diferències significatives entre els conjunts d'individus de les diferents tribus, de fet és habitual que tots iniciïn la seva trajectòria amb forts moviments de reorientació (color blau) a baixes velocitats ja que necessiten familiaritzar-se amb l'entorn i el sistema de seguiment. A mesura que es van familiaritzant amb aquest entorn, comencen a accelerar (color groc) fins a assolir una velocitat mitjana estable, que modulen en funció de les posteriors reorientacions que prenen per girar i canviar de direcció.
A més, l'angle de la seva fisonomia corporal fa que el cuc segueixi moviments tortuosos transitoris, i l'error associat (σφ) intervé activament en el modelatge de les seves trajectòries.
Conclusions
Això té sentit, ja que el cuc ha de frenar per girar, i és aquí quan aquests valors s'atribueixen fortament a una distribució de tipus gamma. D'altra banda, la velocitat angular que prenen els individus d'ambdues soques es pot classificar en una distribució de Lorentz-Cauchy (figures 16 i 17), amb la qual es detecta que la velocitat angular que prenen els individus durant els fenòmens de reorientació és inferior a la observada durant els processos de fluència. Finalment, la possibilitat de caracteritzar aquests dos aspectes rellevants en la biologia dels nematodes és la base de futurs estudis en què una possible interconnexió entre la microbiota intestinal i el moviment de C.
Línies de futur
Seguiment de la planificació
URL: https://www.R-project.org/. RStudio, Inc., Boston, MA URL: http://www.rstudio.com/. Langevin diffusion as a time-continuous model of animal movement and habitat selection. Community assembly of the C. elegans native microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Assessment of motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide-field nematode tracking platform.
Gràfics de qualitat dels datasets
Gràfics de locomoció de la resta d’individus
Codi generat
