Las mejores condiciones de sacarificación para la liberación de hasta un 6% de glucosa fueron, cuando se utilizó la enzima comercial Celluclast, a 25 UPF/g de harina y 48 h. Finalmente, en el proceso secuencial con las mejores condiciones para la hidrólisis química y enzimática de la harina de cladodio de nopal, se determinó el perfil de azúcares liberados.
ANTECEDENTES
JUSTIFICACIÓN
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
O BJETIVO GENERAL
O BJETIVOS ESPECÍFICOS
FUNDAMENTACIÓN
- ORIGEN, DISTRIBUCIÓN Y TAXONOMÍA DE LOS NOPALES
- C ARACTERÍSTICAS GENERALES DEL NOPAL
- C OMPOSICIÓN FITOQUÍMICA Y FISICOQUÍMICA DEL NOPAL
- P RODUCCIÓN DE NOPAL EN M ÉXICO
- P ERSPECTIVAS DEL USO DE NOPAL PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL
- E STRUCTURA Y COMPOSICIÓN DE LOS PRINCIPALES POLISACÁRIDOS PRESENTES EN EL
- S ACARIFICACIÓN
- P RINCIPALES ENZIMAS COMERCIALES EMPLEADAS EN PROCESOS HIDROLÍTICOS
Disolventes orgánicos: El pretratamiento con disolventes orgánicos es eficaz para eliminar la lignina pero no para eliminar la hemicelulosa. Oxidación húmeda: Es un método eficaz para aumentar la digestibilidad enzimática de la celulosa y eliminar la lignina.
PROCEDIMIENTOS
- M ATERIA PRIMA
- C ARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA Y FITOQUÍMICA
- Determinación de humedad
- Determinación de cenizas
- Determinación de color
- Determinación de minerales
- Determinación de pH
- Determinación de proteína soluble
- Cuantificación de polifenoles totales
- Determinación de flavonoides totales
- D ETERMINACIÓN DE AZÚCARES
- Determinación de azúcares reductores libres
- Determinación de carbohidratos totales
- Determinación de glucosa y sacarosa
- Determinación cualitativa de azúcares mediante la prueba de Fenilhidrazina
- Determinación del porcentaje de sacarificación
- D ETERMINACIÓN DE F URFURAL E H IDROXIMETILFURFURAL
- P RETRATAMIENTO DE HIDRÓLISIS QUÍMICA EN FRESCO Y EN HARINA DE CLADODIOS DE
- D ETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD CELULOLÍTICA
- D ETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE ENDO - Β -1, 4- G LUCANASA POR C ARBOXIMETIL
- D ETERMINACIÓN DE ALCOHOL
La determinación del color de los cladodios frescos y de la harina de nopal se realizó mediante un colorímetro Mini-Scan (marca Hunter Lab). Desarrollo de una curva de calibración y uso de un estándar de albúmina sérica bovina (BSA) en un rango de concentración de 0 a 0,5 mg/ml. La absorbancia se midió a 760 nm frente a una curva de calibración de concentraciones conocidas de ácido gálico en un rango de concentración de 0,025 a 0,2 mg/ml (Apéndice 2).
La determinación se llevó a cabo utilizando curvas estándar de concentraciones conocidas de sacarosa o glucosa en el rango de concentración.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
M ATERIA PRIMA
C ARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA
El contenido total de carbohidratos determinado en la harina utilizada en el presente trabajo fue del 30% y el contenido de calcio fue uno de los más bajos de las variedades evaluadas. En relación a la viscosidad, esta se determinó en un viscosímetro marca Brokfield, como se puede observar en el Apéndice 11, la concentración de harina de nopal en agua al 10% tuvo un máximo de (Pa) respecto a la concentración del 20% cuya viscosidad máxima era de (Encendido). 38 Cladodios de nopal frescos y recién cortados se almacenaron en bolsas herméticamente cerradas (ziploc) y se congelaron a -20 °C para su posterior análisis (Figura 16).
La concentración de compuestos antioxidantes fue de 1,37 mg de polifenoles totales y 0,60 g de flavonoides por g de cladodios de nopal fresco, el cual es mucho menor que el extraído en la harina. Esto puede deberse al contenido de humedad del material fresco, lo que provoca la pérdida de polifenoles al momento de secar y moler los cladodios.
H IDRÓLISIS QUÍMICA EN FRESCO
Como podemos ver en la tabla 14 se forman 2 grupos homogéneos cuando el hidrolizador es: Hidróxido de potasio o ácido sulfúrico e hidróxido de sodio o ácido fosfórico, en la tabla 15 de igual manera podemos ver 2 grupos homogéneos que corresponden al efecto de la concentración donde se encuentra el concentración de 0.5 o 0.75 N es un grupo homogéneo, mientras que el otro grupo es para la concentración 1 N. En las tablas 16 y 17, que corresponden a los factores temperatura y tiempo respectivamente, podemos notar que no se forman grupos homogéneos. es decir, cada nivel es diferente entre sí, siendo la temperatura de 30 °C y el tiempo de 45 minutos los que mejor respuesta tienen en cuanto a concentración de glucosa. La Figura 18 muestra los resultados para cada uno de los factores establecidos, dependiendo de la respuesta seleccionada; es decir, la concentración de glucosa liberada.
En la Figura 20 podemos ver que todas las interacciones en la hidrólisis básica no producen Hidroximetilfurfural, a diferencia de lo que ocurre en la hidrólisis ácida donde se pueden producir hasta 35 ppm.
D ETERMINACIÓN DEL TIPO DE AZÚCAR
H IDRÓLISIS QUÍMICA DE HARINA DE CLADODIOS DE NOPAL
48 Para la hidrólisis de la harina de nopal, los agentes de hidrólisis ácida generalmente liberan la mayor cantidad de glucosa, hasta un 5%, en contraste con los agentes alcalinos, que liberan solo hasta un 3.5%. Este resultado es similar al reportado por (Ferreira et al. 2016) donde utilizan 3 pretratamientos diferentes: alcalino con peróxido de hidrógeno, alcalino con hidróxido de sodio y ácido con ácido sulfúrico sobre 2 especies de cactus (Opuntia ficus indica y Nopalea Cochenillifera), Liberar el 30% de la reducción total con el proceso alcalino. de azúcares, que es mucho menor de lo esperado, pero combinando este método con el tratamiento ácido, logran duplicar la liberación de azúcares reductores hasta alcanzar el 60% de liberación, debido a que la hidrólisis ácida diluida aumenta el grado de solubilización de la hemicelulosa, mientras que la alcalina el pretratamiento permite romper los puentes entre la lignina y los carbohidratos, cambiando la estructura de la lignina y facilitando su liberación (Conde-Mejía, Jiménez-Gutiérrez y El-Halwagi 2012). Para este estudio, el análisis de varianza (ANOVA) mostrado en el Cuadro 20 de la hidrólisis química de la harina de cladodio de nopal mostró que hubo interacciones (AB, AC, AD, BC, CD, ABC y ACD) que tuvieron un efecto estadísticamente significativo en la cantidad de glucosa formada durante la hidrólisis de la harina de nopal (p < 0,05); También vale la pena señalar que los factores principales: hidrolizador (A), concentración (B) y temperatura (C) afectan la variable respuesta, ya que el valor P es inferior al nivel de significancia establecido de α= 0,05. La Figura 23 presenta las diferentes interacciones, donde se puede observar que en la interacción hidrolizado-concentración (AB) (Figura 23a), el ácido fosfórico libera aproximadamente el 4.3% de la glucosa de la harina de nopal a una concentración de 0.5 N, en la interacción hidrolizado-temperatura. interacción (AC) (Fig. 23b) vemos que el ácido sulfúrico y la temperatura de 95 °C tienen el mayor efecto en comparación con los otros hidrolizadores, liberando hasta 4.2 g de glucosa/100 g de harina de nopal en base seca, en la Fig. .23c, que corresponde a la interacción del agente .
49 tiempo de hidrólisis (DA), podemos observar que el ácido sulfúrico tiene un efecto pronunciado en la liberación de glucosa, la cual no se ve afectada por el tiempo de hidrólisis donde se libera aproximadamente hasta 4.0 g de glucosa/100 harina de nopal en base seca. Interacción temperatura-tiempo (BC) (Figura 23d) la mejor condición es tratar una temperatura de 30 °C con una concentración de 0.5 N, al final de la interacción temperatura-tiempo (CD) (Figura 10e) liberar hasta 3.2% la glucosa es suficiente para soportar una temperatura de 30°C y un tiempo de 45 minutos.
D ETERMINACIÓN DE F URFURAL E H IDROXIMETILFURFURAL POR C ROMATOGRAFÍA
52 hidroximetilfurfural, estos se pueden observar en la figura 25. Las condiciones en las que se obtuvo la mayor cantidad de azúcares reductores totales (1N, 95°C y 70 min), alcanzaron la liberación de hasta 4,28 g de glucosa y 23,61 g fermentables. azúcares por cada 100 g de harina de nopal cladodio, liberando sólo 30 ppm de HMF. Para el tratamiento con H2SO4 de 0,75 a 1 N realizado a 95 °C y 120 min, se libera un máximo de 70 a 80 ppm de HMF. Esta concentración de HMF resulta ser mucho menor que la concentración inhibidora reportada por otros autores. , quienes lo utilizan para la cepa Saccharomyces cerevisiae y demuestran que el HMF afecta la producción de etanol a partir de 500 ppm, presentándose una inhibición completa a partir de 4000 ppm (Tello y Vinicio 2013), además (Gracida y Pérez 2014) reportan inhibición de la fermentación hasta 20 ppm. HMF que causa un 70% de inhibición de Saccharomyces.
S ACARIFICACIÓN DE HARINA
Finalmente, para expresar correctamente la relación entre la concentración de glucosa liberada y la cantidad de enzima utilizada, se determinó la producción de glucosa en relación con la actividad enzimática específica de cada enzima. Además se realizó el análisis estadístico de estos resultados y de acuerdo a esto se observó que el factor tipo enzima fue el único que tuvo un efecto significativo en la variable Glucosa (Figura 28), donde podemos observar que la enzima Celluclast libera aprox. hasta un 6% de glucosa procedente de harina de cladodio de nopal pretratada químicamente. Los demás factores no tuvieron efecto, por lo que las mejores condiciones para liberar hasta un 6% de glucosa fueron: Enzima celuclasto comercial, a 25 UPF/g de harina durante 48 horas.
P ROCESO SECUENCIAL EN HARINA DE NOPAL
56 Como podemos observar se obtuvo una liberación de hasta un 32,48% de azúcares fermentables, similar a lo obtenido por (Kuloyo et al. 2014) hasta un 32,9%. De igual forma, en la hidrólisis enzimática utilizaron una mezcla multienzimática de Celluclast 15 UPF/mL, Novozyme 15 UI y Pectinex Ultra SP-L 100 U por gramo de biomasa seca (Kuloyo et al. 2014). El diagrama de flujo del proceso secuencial propuesto en este trabajo de tesis se describe en la Figura 29, como podemos observar, en comparación con los reportes para el mismo sustrato, logramos un buen desempeño utilizando solo un tipo de enzima.
Este proceso se replicó a escala de 2 L, para verificar el proceso, incluyendo la fermentación del producto de la hidrólisis, los resultados se muestran en la siguiente sección.
F ERMENTACIÓN DE HARINA DE NOPAL
Cada etapa del proceso fue seguida por un muestreo, a partir del cual se determinó la cantidad de glucosa, sacarosa, azúcares reductores totales y alcohol liberados. En este caso, en un proceso de hidrólisis similar, la cantidad de glucosa y azúcares reductores liberados durante esta fase de sacarificación se muestra en la Figura 31. 60 Para la fase de fermentación se utilizó un biorreactor de 3 litros (Applikon Biotechnology) con el objetivo de obtener la mayor producción de alcohol: preinóculo preparado de la cepa HY1, que se cultivó en un tubo que contenía 10 ml de YPD a pH 5,5 y se cultivó por duplicado durante 24 h en condiciones de 35 °C y 200 rpm.
La Figura 32 muestra las curvas de consumo de azúcares reductores y producción de alcohol a partir de harina de cladodios de nopal.
CONCLUSIONES
63 La baja cantidad de alcohol producido se atribuye a que la concentración de azúcares fermentables liberados fue solo el 50% de lo logrado en el proceso a pequeña escala, por lo que es necesario continuar evaluando el pretratamiento y la sacarificación. condiciones., al nivel de 2 L, para verificar las condiciones para lograr mayor liberación de azúcares para la posterior fermentación y así lograr una alta productividad de alcohol.
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
Proximate Characterization of Composition, Phenolic Acids and Flavonoids of Commercial and Wild Nopal (Opuntia Spp.).” Journal of Food Composition and Analysis. Sodium hydroxide pretreatment and enzymatic hydrolysis of oil palm mesocarp fibers.” International Journal of Chemical Engineering and Applications. Effect of extraction conditions on chemical characteristics of pectin from Opuntia Ficus Indica Cladode flour.” Journal of Polymers and the Environment.
Protein extraction from defatted soybean meal with Viscozyme L pretreatment.” Journal of Food Processing and Preservation.
ANEXOS
- M ÉTODO DE L OWRY
- C URVA DE CALIBRACIÓN PARA LA CUANTIFICACIÓN DE POLIFENOLES TOTALES
- C URVA DE CALIBRACIÓN PARA LA CUANTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES TOTALES
- M ÉTODO DE M ILLER ET AL ., 1959 (Á CIDO DINITROSALICÍLICO , DNS)
- M ÉTODO DE D UBOIS ET AL ., 1956 (F ENOL - SULFÚRICO )
- O SAZONAS DE ALGUNAS AZÚCARES
- C ROMATOGRAMAS DE H IDROXIMETILFURFURAL Y FURFURAL POR UPLC
- D ETERMINACIÓN DE UNIDADES DE PAPEL FILTRO
- D ETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE ENDO - Β -1, 4- G LUCANASA POR C ARBOXIMETIL
- M ÉTODO DE B OHRIMNGER ET AL ., 1964 (D ICROMATO DE POTASIO )
- G RAFICAS DE VISCOSIDAD DE NOPAL
- P RESENTACIONES EN CONGRESOS
- Presentación en 3 er Congreso de la Facultad de Ingeniería Química, 2015
- Reconocimiento de 2° lugar en presentaciones orales del CONFIQ-3, 2015
- Seminario Nacional de los Estudiantes del PICYT, 2015
- Simposio internacional del carbono en México, 2016
Disolver los reactivos en 500 mL de agua destilada poco a poco hasta su completa disolución. Pasado este tiempo, enfriar en baño de hielo, luego agregar 8 ml de agua destilada, agitar y leer la absorbancia a 550 nm. Prepare una solución de fenol al 5% pipeteando 5,1 ml de fenol líquido, disuélvala en agua destilada, lleve a volumen en un matraz de 100 ml y guárdela en una botella de color ámbar.
Agregar 1 mL de solución estándar correspondiente a cada uno de los puntos de la curva de calibración en tubos de ensayo, agregar 1 mL de solución de fenol al 5%.
