Preparación de medios de cultivo
Curso: “Métodos en fitopatología”
Dr. Pedro Mondino 24 de abril de 2009
Objetivos
Conocer a que denominamos medio de cultivo en el laboratorio de Fitopatología.
Reconocer la existencia de diferentes tipos de medio.
Reconocer la utilidad de los diferentes medios de cultivo en el trabajo con patógenos de plantas.
Objetivos
El alumno debe:
1) ser capaz de elaborar medios de cultivo con el fin de ser utilizados posteriormente para el aislamiento de hongos, bacterias o microorganismos epifíticos.
2) Desenvolverse con soltura en la utilización de protocolos.
Medios de cultivo
Los medios de cultivo de microorganismos (hongos, bacterias, levaduras) son esenciales en el Laboratorio de Fitopatología por lo que a diario se preparan y utilizan.
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos.
Condiciones que debe reunir un Medio de cultivo
Para que los microorganismos crezcan adecuadamente, un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones:
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
disponer de oxígeno
temperatura adecuada
humedad
Disponibilidad de nutrientes en los Medios de cultivo.
Un medio de cultivo para que permita el crecimiento adecuado de microorganismos debe contener como mínimo:
Carbono
Nitrógeno
Azufre
Fósforo
Disponibilidad de nutrientes en los Medios de cultivo
Estos nutrientes generalmente se aportan con Extracto de malta, Peptona, Papa, extracto de levadura, etc.
Medios de cultivo según su composición
Medios Naturales. Consisten únicamente en un material vegetal. Ejemplos: un trozo de papa. Agar jugo de manzana, Agar durazno, Agar y jugo de vegetales.
Medios de cultivo según su composición
Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cuali y cuantitativamente.
Generalmente se usan en trabajos de investigación.
Ej: Medio Czapek.
Nitrato de Sodio 2 g/l
Fosfato bipotásico 1 g/l
Cloruro de potasio 0,5 g/l
Sulfato de magnesio heptahidratado 0,5 g/l
Sulfato de hierro heptahidratado 0,01 g/l
Sacarosa 30 g/l
Agar-agar 15 g/l
Medios de cultivo según su composición
Medios complejos o de composición indefinida: Son medios cuya composición no se conoce con exactitud.
contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.
Ej: Agar Papa; Agar Malta;
Medios complejos
Agar Papa Dextrosa:
Medio para el cultivo y conteo de levaduras y hongos en general.
Agar -15g
Dextrosa - 20g
Infusión papa - 4g
Agua destilada 1L
Medios de cultivo según su estado físico
Los medios de cultivo utilizados pueden ser de diferentes tipos:
Medios sólidos.
Medio semisólidos.
Medios líquidos.
Medios de cultivo Medios sólidos de cultivo
Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar
El agar es un polisacárido extraído de algas.
En los medios sólidos la proporción de Agar es siempre por encima del 15%
Medios de cultivo
El agar es el elemento solidificante más empleado en la preparación de medios de cultivo.
Sus características principales son:
Se licua completamente a temperaturas de 80 –100 ºC y se solidifica al enfriarse a 40 grados.
No afecta el crecimiento de hongos ni bacterias.
No es utilizado por los microorganismos que crecen en él.
Medios semi-sólidos de cultivo
En los medios semi-sólidos la proporción de Agar es de alrededor del 5%
Medio Agar Agua
Se trata de un medio sin el agregado de nutriente alguno.
Utilidad
Aislamiento de hongos a partir de tejido vegetal. Se logra que el crecimiento sea el resultado de la nutrición que posee el tejido vegetal.
Ensayos de evaluación de actividad antifúngica.
Medios de cultivo
En ocasiones se añaden al medio de cultivo sustancias indicadoras de actividades metabólicas.
También se pueden añadir sustancias que ejercen acción inhibitoria selectiva de ciertos microorganismos.
Medios de cultivo
La exactitud en los procedimientos de fabricación, preparación, conservación y uso, de los medios de cultivo asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos en los ensayos o experimentos.
Medios de cultivo según su utilidad práctica
Generales: Sirven para el cultivo de una gran variedad de microorganismos.
Ej: Agar Papa destrosado (PDA); Agar Nutriente (NA)
Selectivos: Son medios a los que se les agregan sustancias para inhibir el crecimiento de otros microorganismos.
Ej: Agar Malta acidificado y con antibiótico para inhibir el crecimiento de bacterias.
Diferenciales:
Medios de cultivo según su utilidad práctica
Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.
Medios de cultivo según su utilidad práctica
Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo particular o grupo de microorganismos. Es de gran utilidad para el aislamiento de
microorganismos a partir de una población microbiana mixta
Temperaturas de incubación
En general los microorganismos patógenos de plantas crecen a temperaturas en el entorno de 24 a 28 ºC.
En ocasiones incubamos a temperaturas diferentes:
A 37 ºC cuando queremos descartar el crecimiento de agentes de control biológico a la temperatura del cuerpo humano.
A 5ºC o menos cuando buscamos microorganismos
Condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas de los cultivos microbianos.
En las estufas de cultivo se debe
proporcionar una fuente adecuada de
humedad para evitar así que se deseque el
Presencia de oxígeno
Los microorganismos aerobios necesitan que el oxígeno llegue en forma adecuada al medio.
En los medios líquidos se recurre a la agitación, de lo contrario solamente habrá crecimiento en la parte superior.
Presencia de oxígeno
Los microorganismos aerobios necesitan que el oxígeno llegue en forma adecuada al medio. Los anaerobios por el contrario crecen en ausencia de oxígeno. Ej. Erwinia
Preparación de medio Agar Malta con antibiótico
Receta del agar malta
Extracto de malta 20 g/L.
Agar 20 g/L
pH = 5,4
Sulfato de estreptomicina al 0,02%
(0,1 ml de la solución stock/100 ml de medio).
Preparación de medio Agar Nutriente
Receta NAD (Nutriente agar destrosa)
Agar nutriente 23g
Destrosa 5g
Agua destilada 1000 ml.
Preparación de medio Agar Nutriente
3 g de extracto de Carne de buey
5 g de peptona trípsica de gelatina
15 g de agar
de cloruro sódico y glucosa
agua destilada hasta 1000 ml
Esterilidad de los Medios de cultivo
Los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar otros microorganismos puedan interferir con el crecimiento del que queremos cultivar.
Los medios de cultivo se esterilizan en el autoclave.
Medios de cultivo
En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de vidrio planas
Hoy existen de plástico.
Procedimiento seguido para dispensar el medio en placas de Petri
Medios de cultivo
Los medios se pueden utilizar en frascos, placas de Petri o tubos.
