En este trabajo se realizó la producción de esterasa en Escherichia coli (EcBL21) a partir del plásmido PET 28a y del gen lip C de la arquea halófila Haloarcula marismortui (Hm), con el fin de realizar un estudio de la actividad de esta enzima en la hidrólisis y reacciones de síntesis por primera vez. De esta manera, en este trabajo fue posible darse cuenta del uso potencial de ERHm en biocatálisis con agentes de reacción no convencionales.
BIOCATÁLISIS
Uso de los solventes orgánicos y sus efectos en biocatálisis
Reemplazar el agua con un solvente orgánico tiene diferentes efectos sobre las reacciones enzimáticas. Si bien la interacción entre solventes y enzimas es compleja, existen diversos fenómenos que se aplican a la biocatálisis en medios orgánicos, donde el comportamiento de la enzima, a diferencia de lo que ocurre en medios acuosos, puede cambiar drásticamente, dando lugar a propiedades interesantes como: Cambios en la selectividad del sustrato. (enantio, regio y quimioselectividad), mayor estabilidad por inactivación de la proteólisis, aumento de la termoestabilidad, cambio del equilibrio termodinámico hacia síntesis en lugar de hidrólisis, entre otros (Tabla 1).
Clasificación de los solventes utilizados en biocatálisis
El parámetro más común para determinar la polaridad del solvente es el coeficiente de partición molar o logP. Por tanto, el coeficiente es una medida de la diferencia en la solubilidad del compuesto en estos dos disolventes.
ENZIMAS
Características generales de las enzimas y su aplicación en biocatálisis
- Preparación de enzimas para su uso como biocatalizadores
Existen varios métodos para preparar enzimas como biocatalizadores para su uso en reacciones. La inmovilización enzimática amplía el campo de aplicación, permitiendo que enzimas menos estables desarrollen procesos de biocatálisis.
Efecto de los solventes orgánicos en las enzimas
HIDROLSAS
ESTERASAS
Características estructurales de las esterasas
La tríada catalítica está compuesta por Ser-Asp-His y suele presentar una secuencia consenso Gli-x-Ser-x-Gli que se encuentra alrededor de la serina catalítica (Figura 3). Las posiciones relativas de los aminoácidos que forman la tríada catalítica están indicadas por círculos rojos.
Mecanismo de reacción de las esterasas
Su estructura tridimensional muestra una disposición característica de hidrolasa que se refiere a una disposición de hélices y láminas que también se encuentran en otras hidrolasas. En verde se muestra el alcohol (R'XH donde X en el caso de los ésteres se refiere a O) como subproducto de la primera reacción, y el ácido carboxílico como producto final.
APLICACIONES DE LAS ESTERASAS
13. ocurre para provocar la formación de un nuevo intermedio tetraédrico 3) este segundo intermedio tetraédrico se hidroliza, dando como resultado la formación de un producto que se libera y así regenera la enzima (Figura 4). Alternativamente, otro nucleófilo, como un alcohol, puede atacar el complejo acil-enzima para producir un nuevo éster [8].
FUENTES DE OBTENCIÓN DE ESTERASAS
MICROORGANISMOS EXTREMÓFILOS
Clasificación de los microorganismos extremófilos
La mayoría de los extremófilos pertenecen al dominio arquea dentro del cual se reconocen especies psicrófilas, mesófilas, halófilas, termófilas e incluso metanogénicas (Tabla 3) [5, 12]. Además, también se han descubierto arqueas mesófilas, aunque la mayoría de las especies de arqueas se han descubierto en ambientes extremos [12].
ARQUEAS
Características de las arqueas
- Células de arqueas
Las cadenas de los fosfolípidos de bacterias y eucariotas son ácidos grasos (16-18 átomos de carbono), mientras que las arqueas utilizan cadenas de isopreno (20 átomos de carbono). Debido a que las cadenas de fosfolípidos de las arqueas están compuestas de isopreno, están ramificadas, a diferencia de los ácidos grasos de bacterias y eucariotas, que no tienen ramificaciones.
ARQUEAS HALÓFILAS
Características de arqueas halófilas
Clasificación de arqueas halófilas
Aplicaciones
ENZIMAS HALÓFILAS
Características de las enzimas halófilas
Las enzimas halófilas tienen una disposición de aminoácidos característica que muestra un exceso de residuos hidrofóbicos de alrededor del 68% en relación con los residuos alifáticos distribuidos principalmente en la superficie de la enzima en comparación con su interior (Figura 7) [20]. Las características estructurales más importantes de las enzimas halófilas se pueden describir como se muestra en la Tabla 6.
Modelo de adaptación halofílica
Alto contenido (más del 20% de todos los residuos) de residuos de ácido aspártico y glutámico en grupos en la superficie de la enzima. La dependencia de la estabilidad y las propiedades catalíticas de las proteínas halófilas de altas concentraciones de sal ha sido objeto de estudio durante muchos años.
Enzimas de arqueas halófilas
Las enzimas halófilas son generalmente muy inestables e inactivas en bajas concentraciones de sal y muy solubles en altas concentraciones de NaCl, pero cada enzima puede comportarse de manera diferente. En bajas concentraciones de sal, la enzima era activa en cloroformo y en presencia de etanol y acetona no se detectó actividad enzimática [30].
Haloarcula marismortui
Características generales
Recientemente, la proteasa Haloferax lucentensis mostró estabilidad en presencia de un 25% de disolventes polares y no polares, manteniendo la actividad de la enzima por encima del 50% en todos los casos [31].
Descripción del genoma de Har. marismortui y sus enzimas estudiadas
ESTERASAS DE Har. marismortui
Producción recombinante
Finalmente, probaron la estabilidad de HmEST en disolventes orgánicos y, curiosamente, descubrieron que esta enzima era estable en disolventes polares como el acetonitrilo y el DMSO [32]. Por estas razones, sería interesante verificar la capacidad de esta enzima para catalizar reacciones de esterificación o resolución de compuestos racémicos como perspectiva para utilizar esta enzima en reacciones de biocatálisis.
Producción nativa
Luego realizaron la caracterización bioquímica de la esterasa recombinante, revelando una dependencia total de la sal para el plegamiento y la actividad de HmEST, demostrada mediante análisis de dicroísmo circular. Los resultados de este trabajo nos permitirán comprender mejor las propiedades de las enzimas arqueales halófilas y proporcionarán la base para analizar el uso potencial de ERHm en reacciones de biocatálisis.
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos específicos
Sin embargo, el número de enzimas conocidas que podrían estar activas en estos medios es pequeño, principalmente debido a los cambios conformacionales que sufren en medios no acuosos. Recientemente, se pudo obtener esterasa lipC recombinante de Haloarcula marismortui [32], pero no se ha informado de su uso en reacciones de hidrólisis y síntesis en medios no convencionales.
MATERIALES
TÉCNICAS ANALÍTICAS
- Ensayos de determinación de actividad enzimática
- Método espectrofotométrico de los ésteres de p-nitrofenilo
- Método espectrofotométrico discontinuo de los ésteres de p-nitrofenilo
- Método titrimétrico pH-Stato
- Electroforesis de ADN
- Electroforesis de proteínas
- Zimogramas de actividad
- Determinación de proteína
- Cromatografía de capa fina
La cinética de actividad se determinó durante 15 minutos a intervalos de 2 minutos tomando 200 L de la mezcla de reacción leída a 410 nm. Se utilizaron microplacas de 96 pocillos y por pocillo se depositaron 5 L de la muestra y 250 L de reactivo Bradford de Sigma.
TRANSFORMACIÓN DE E. coli CON los plásmidos pET 14b-lipC y pET 28a-lipC Y EXPRESIÓN
- Cepa y plásmido recombinante
- Medio de cultivo
- Condiciones de cultivo
- Antibióticos
- Inductor
Se realiza migrando la muestra en una fase estacionaria con la ayuda de una fase móvil. COLI CON PLASMIDOS pET 14b-LIPC Y pET 28a-LIPC Y EXPRESIÓN DE ESTERASA LABIAL RECOMBINANTE.
PRODUCCIÓN DE LA ENZIMA
- Conservación del inóculo
- Preparación del inóculo
- Cultivo en matraz
- Cultivo en biorreactor
Luego, se añadió IPTG 1 mM para inducir la expresión y los cultivos se incubaron durante 4 h antes de recolectar las células mediante centrifugación a 4500 rpm y 4 °C durante 15 min. Se agregaron 40 ml de tampón de lisis a cada paquete de células obtenidas de un litro de cultivo y las células se lisaron mediante sonicación.
PURIFICACIÓN
Preparación de la muestra
Después de que el cultivo alcanzó la DO deseada, se añadió IPTG 1 mM para inducir la expresión y el cultivo se incubó durante más de 4 h.
Soluciones
En este caso, la enzima halófila se eluyó por gravedad con el tampón de equilibrio y los contaminantes quedaron retenidos en la matriz.
ACTIVIDAD EN HIDRÓLISIS EN MEDIOS DE REACCIÓN NO CONVENCIONALES
Preparación de la muestra
Se utilizó una matriz de Octyl Sepharose CL-4B empaquetada en una columna BioRad Poly-prep. En este caso se utilizó como enzima halotolerante el extracto comercial Cal B de Sigma en presentación líquida y en el caso de la enzima no halofílica se utilizó el extracto comercial Lipex de Novozymes en presentación líquida.
ENSAYOS DE INMOVILIZACIÓN Y LIOFILIZACIÓN
Inmovilización
Luego la suspensión se filtró al vacío usando una membrana de 0,45 µm y el soporte se lavó en un desecador con CaCl anhidro durante 24 a 48 horas. Una vez completado el proceso de inmovilización, la suspensión se filtró al vacío usando una membrana de 0,45 µm y el soporte se lavó en un desecador con CaCl anhidro durante 24 a 48 horas.
Liofilización
Luego la resina equilibrada se mezcló con la enzima purificada con AC y se dejó en agitación a 4°C durante 24 h. En este caso, la actividad del sobrenadante a lo largo del tiempo se determinó mediante el método espectrofotométrico.
ACTIVIDAD DE SÍNTESIS EN MEDIOS DE REACCIÓN NO CONVENCIONALES
A continuación se mostrará el estudio de la actividad de hidrólisis de ERHm, discutiéndose el efecto de la sal y los disolventes orgánicos sobre la actividad de esta enzima. A continuación se presentará el estudio de la actividad de ERHm en su síntesis, por lo que hablaremos de las diferentes formas ensayadas para la preparación de un biocatalizador a partir de esta enzima. Finalmente, en esta sección se describirán las diferentes reacciones de síntesis realizadas utilizando estos biocatalizadores. son exhibidos. .
EXPRESIÓN DE LA ESTERASA RECOMBINANTE lipC DE Har. marismortui EN E. coli
Transformación de las células de E. coli con los plásmidos recombinantes
En primer lugar, se mostrará y discutirá la información obtenida de la transformación de E. coli con los plásmidos recombinantes, seguido de la expresión de ERHm. En la siguiente sección se abordará la cuestión de la producción y purificación a mayor escala de la enzima recombinante.
Expresión de ERHm en E. coli
Por otro lado, también existen trabajos de expresión en huéspedes halófilos, como es el caso de aquellos que sobreexpresan una Hbt glutamato deshidrogenasa. El sistema de expresión heterólogo en E. coli se utiliza para la expresión de enzimas de arqueas halófilas a pesar de tener una maquinaria celular diferente.
Selección del clon de trabajo
Actividad enzimática en pNPB de los diferentes clones obtenidos con los plásmidos pET 14b-lipC y pET 28a-lipC. La prueba se realizó por el método espectrofotométrico a 30°C. Actividad VC4 de los extractos enzimáticos obtenidos con los plásmidos pET 14b-lipC y pET 28a-lipC.
PRODUCCIÓN DE ERHm
Entre estos sistemas utilizados para la producción de ERHm, se optó por utilizar el sistema de matraz para producciones posteriores de esta enzima. coli se transformó para expresar ERHm en diferentes sistemas de producción. En cuanto al cultivo de E. 2003) informaron del cultivo de esta cepa para la producción de enzimas recombinantes utilizando el sistema de biorreactor [47, 48].
PURIFICACIÓN CROMATOGRÁFICA DE ERHm
Ensayos zimográficos
Es interesante observar la presencia de una discreta banda de actividad en el extracto crudo con ambos sustratos, la cual desaparece luego de la cromatografía de afinidad. En ambos casos, la muestra A corresponde al extracto crudo de ERHm y la muestra B corresponde al extracto de ERHm tras su purificación mediante cromatografía de afinidad.
ACTIVIDAD DE HIDRÓLISIS DE ERHm EN MEDIOS DE REACCIÓN NO CONVENCIONALES
Acil especificidad de ERHm
En experimentos de hidrólisis con la enzima en solución acuosa, EstP mostró actividad con ésteres de p-nitrofenol con longitudes de cadena de C6 y C8. Es interesante observar que el perfil de actividad esterasa es muy similar en todos los casos, incluido el caso de ERHm donde la preferencia hacia los ésteres de cadena corta es clara.
Efecto de la concentración de sal en la actividad de ERHm
Efecto de la concentración de NaCl sobre la actividad de ERHm y enzimas no halófilas: Cal B y Lipex. En cuanto al comportamiento de las enzimas de referencia, es interesante observar los perfiles obtenidos comparados con los de la ERHm.
Efecto del tipo de solvente, concentración de solvente y concentración de sal en la
Por esta razón, el contacto con disolventes probablemente provocó una disminución en la actividad de ERHm. La actividad enzimática aumentó con los disolventes probados después de la incubación a una concentración moderada (2 a 5 M) y la inhibición a una concentración alta (10 M) [25].
ENSAYOS DE INMOVILIZACIÓN Y LIOFILIZACIÓN
Cabe mencionar que la inmovilización con los demás soportes utilizados en este experimento resultó en una inmovilización sin la actividad del ERHm. Estos resultados indican que es posible obtener un biocatalizador de ERHm mediante liofilización en presencia de KCl, pero este proceso en realidad reduce la actividad enzimática.
ACTIVIDAD EN SÍNTESIS DE ERHm EN MEDIOS ORGÁNICOS
Técnicas de visualización en cromatografía de capa fina utilizadas para el monitoreo
En estos casos, se probaron diversas técnicas de desarrollo de placas de cromatografía en capa fina para controlar las reacciones. La Figura 21 muestra placas de ésteres comerciales que muestran los colorantes utilizados, pero se observó que la mayoría de los sustratos de cadena corta, ya sean ácidos o alcoholes, eran imposibles de visualizar mediante cualquiera de las técnicas utilizadas.
Reacciones de síntesis de ésteres utilizando BERHm
Camacho, r.m., et al., Production and characterization of esterase and lipase from Haloarcula marismortui, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 36: 7, p. Timpson, l.m., et al., Characterization of alcohol dehydrogenase (adh12) from Haloarcula marismortui, an extreme halophile from the Dead Sea, extremophiles, 16: 1, p.
