INTRODUCCIÓN
ANTECEDENTES
- Principales características e importancia económica del cultivo del tomate
- Generalidades de Fusarium spp
- Ciclo de vida de Fusarium spp
- Principales efectos ocasionados por los fungicidas
- Importancia del estudio del ecosistema de Manglar
- Características generales de los actinomicetos
- Actinomicetos como agentes de biocontrol
- Principales mecanismos antagónico de los actinomicetos
- Producción de antibióticos
- Competencia por espacio y nutrimientos
- Producción de sideróforos
- Producción de enzimas líticas
- Compuestos orgánicos volátiles (COVs)
- Inducción de resistencia
- Principales características del quitosano
- Propiedades antimicrobianas del quitosano
- Efecto del quitosano en los hongos fitopatógenos
- Reconocimiento molecular del quitosano
Además, desempeñan un papel ecológico importante en el ciclo de nutrientes del suelo (AbdElgawad et al., 2020). Se caracterizan por un alto contenido de GC (guanina y citosina) en su material genético (AbdElgawad et al., 2020). Los actinomicetos producen metabolitos secundarios con propiedades antifúngicas que inhiben el crecimiento de fitopatógenos (Alblooshi et al., 2022).
El reconocimiento de patrones moleculares da como resultado una primera línea de defensa (respuesta) llamada inmunidad activada por PAMP, MAMP y DAMP (PTI) (Bigeard et al., 2015). Es un polímero lineal formado por monómeros de N-D-glucosamina (2-amino-2-desoxi-β-D-glucopiranosa), unidos por un enlace β-1-4 (Katiyar et al., 2015). La quitina es un polisacárido lineal compuesto de unidades de 2-acetilamina-2-desoxi-β-D-glucopiranosa (Peter et al., 2020).
Es muy hidrófobo y por tanto insoluble en agua y en la mayoría de disolventes orgánicos (Santos et al., 2020).
JUSTIFICACIÓN
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos específicos
MATERIAL Y MÉTODOS
- Aislamiento, identificación y patogenicidad de Fusarium spp
- Aislamiento
- Identificación morfológica
- Pruebas de patogenicidad
- Micrografías
- Identificación molecular
- Análisis filogenético
- Aislamiento e identificación de actinomicetos marinos
- Recolección de muestra de suelo de mangle
- Aislamiento de actinomicetos de sedimentos de manglar
- Identificación morfológica de los actinomicetos
- Antagonismo in vitro de actinomicetos marinos vs F. solani
- Identificación molecular
- Análisis filogenético
- Producción de sideróforos por actinomicetos marinos
- Efecto del hierro sobre la actividad antifúngica de F. solani
- Producción de compuestos orgánicos volátiles por actinomicetos marinos
- Efecto antifúngico in vitro del quitosano hacia F. solani
- Efecto antifúngico del quitosano en la germinación de esporas
- Efecto de quitosano en la ultraestructura celular de F. solani
- Biocontrol de actinomicetos y quitosano hacia F. solani en tomate
- Inóculo de actinomicetos, F. solani y concentración del quitosano
- Tratamientos y condiciones de crecimiento
- Evaluación de la severidad de la enfermedad
- Análisis Estadístico
La identificación macroscópica de los aislados de Fusarium spp se determinó por color, diámetro de colonia (mm), esporulación y tipo de micelio (Summerell et al., 2003). Los productos de amplificación se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (SIGMA®) y se tiñeron con gel rojo (0,057 μL mL-1). Se realizó un análisis filogenético utilizando el programa MEGA 7.0.21 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) (Kumar et al., 2018).
Un total de 18 secuencias del género Fusarium fueron alineadas utilizando MUSCLE (Edgar, 2004) con la configuración por defecto y con el programa Gblocks (Talavera y Castresana, 2007) dentro de la plataforma Phylogeny.fr (Dereeper et al., 2008), donde se alinearon segmentos que tenían posiciones variables o espacios fueron excluidos, con bloques retenidos de la alineación múltiple seleccionada. Con las secuencias seleccionadas, se determinó el modelo de evolución del ADN que mejor se ajustaba utilizando MEGA 7.0.21 (Kumar et al., 2018). Los aislados de actinomicetos marinos se identificaron según las siguientes características morfológicas: tipo y color del micelio, textura, forma, borde y altura de la colonia (Shirling y Gottlieb 1966) y tinción de Gram (Duraipandiyan et al., 2010).
Los productos de amplificación se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (SIGMA®) y se tiñeron con gel rojo (0,057 μL mL-1). Los análisis filogenéticos se realizaron con el programa MEGA 7.0.21 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) (Kumar et al., 2018). Al mismo tiempo, se inoculó actinomyces en otra placa con ISP2, cubriendo toda la superficie de la placa (Djebaili et al., 2021).
En el caso de los actinomicetos (A19 y ED48), la inoculación de las cepas (1 ml) se realizó cerca del cuello de la raíz de las plantas de tomate y se roció el quitosano sobre las hojas con un atomizador hasta cubrir completamente las plantas con hojas. . Las plantas fueron tratadas con 1 ml de actinomicetos cerca de la raíz y aspersión foliar con quitosano cada tres días hasta el final del periodo experimental [53 días después de la siembra]. La severidad de la enfermedad (SE) se determinó a los 28 días de la aplicación de los tratamientos mediante la escala Plantas Sin Síntomas de Marlatt et al.; 2 = Clorosis leve y marchitez o retraso del crecimiento; 3 = Clorosis moderada y marchitez o retardo; 4 = Clorosis severa y marchitez o retraso del crecimiento; 5 = Plantas muertas.
En el cual ni = número de plantas en etapa de desarrollo SE, sti = valor de etapa SE (1-5), N = número total de plantas evaluadas y K = nivel de escala más alto (5). Para la incidencia de enfermedades (DI) de experimentos in vivo, los datos se analizaron por separado utilizando la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis porque los supuestos de normalidad y homogeneidad de las varianzas no se cumplieron a pesar de que se transformaron logarítmicamente, en arcoseno o en raíz cuadrada.
RESULTADOS
- Aislamiento e identificación de especies de Fusarium spp
- Características morfológicas macroscópicas
- Características microscópicas
- Patogenicidad de Fusarium spp
- Identificación molecular y análisis filogenético
- Aislamiento e identificación morfológica de actinomicetos marinos
- Pruebas de antagonismo in vitro de actinomicetos frente a F. solani
- Identificación molecular y análisis filogenético
- Producción de sideróforos
- Producción de compuestos orgánicos volátiles (COVs)
- Efecto antifúngico in vitro del quitosano hacia F. solani
- Biocontrol de actinomicetos y quitosano hacia F. solani en plantas de tomate
Características microscópicas de aislados de Fusarium spp.de tomate en CLA (Aislados: 1-8, H: Hifas, M: Macroconidias, MC: Microconidias, C: Clamidesporas). De los ocho aislados de Fusarium spp., sólo H3, H6, H7 y H8 fueron patógenos, provocando un 100% de incidencia de la enfermedad con diferentes niveles de severidad en las plantas (Cuadro 5). El aislado H8 se identificó como el más virulento, mostró una infección sistémica en 15 días y provocó la mortalidad de todas las plantas analizadas y, por lo tanto, se seleccionó para una mayor caracterización SEM e identificación molecular.
Se encontraron microconidias, macroconidias y clamidosporas en el sistema vascular de plantas de tomate, y el aislado H8 fue el causante de síntomas y lesiones asociadas a Fusarium spp. El aislado A19 mostró la mayor actividad antagonista con un PICR de 72%, el cual no mostró diferencias significativas con respecto al tratamiento con un fungicida sintético, mientras que entre los demás aislados, A15 mostró el PICR más bajo con 39.53% (Figura 15a). A19 mostró un PICR de 44.92%, el cual no mostró diferencias significativas con ED48 de origen terrestre y con los demás tratamientos (Figura 15b).
La producción de sideróforos por las cepas de actinomicetos (A20; A19; A18; A15 y ED48) se identificó por la aparición de halos anaranjados o amarillos alrededor de las colonias de actinomicetos. La cepa A19 presentó el mayor halo de producción de sideróforos con 12,2 mm, mostrando diferencias significativas con el resto de los actinomicetos. Por el contrario, la actividad antagonista de los actinomicetos aumentó en presencia de EDTA-Na2.
La cepa A19 mostró la mayor actividad antagónica con un PICR de 76.75%, la cual mostró diferencias significativas con otros actinomicetos, la A18 mostró un PICR de 63.62% (Figura 17). El tratamiento T3 (3 g L-1) mostró la mayor actividad antagonista con un PICR de 81,43%, el cual mostró diferencias significativas con los demás tratamientos. La combinación de actinomicetos (A19 y ED48) con quitosano mostró mayores resultados en variables de crecimiento que cuando se usó solo.
Los mejores resultados se obtuvieron de los tratamientos con actinomicetos (A19 y ED48) como agentes de biocontrol. La incidencia de la enfermedad (ID) fue menor en las plantas de tomate tratadas con los tratamientos de actinomicetos y quitosano, los cuales superaron la aplicación del fungicida sintético. La combinación de actinomicetos con quitosano mostró mejores resultados que su aplicación individual.
En el tratamiento actinomicetos marinos y quitosano (A19+Q) se observaron los valores más bajos de DI (16,67%), mostrando diferencias significativas con el resto de los tratamientos.
DISCUSIÓN
- Aislamiento, identificación y patogenicidad de Fusarium spp
- Aislamiento e identificación de actinomicetos de sedimentos de manglar
- Mecanismos de acción de actinomicetos marinos
- Actividad antifúngica in vitro de quitosano hacia F. solani
- Biocontrol de actinomicetos marinos y quitosano hacia F. solani en tomate
Además, estas enzimas sirven para inactivar componentes proteicos de defensa de las plantas, como las quitinasas y las β-1,3-glucanasas (Roncero et al., 2000). Los actinomicetos aislados de ambientes terrestres han sido ampliamente estudiados y caracterizados como agentes de biocontrol contra fitopatógenos (Benhadj et al., 2019). El ensayo de cultivo dual se ha utilizado para evaluar la actividad antagonista de actinomicetos contra hongos fitopatógenos in vitro (Awla et al., 2017).
Se han utilizado varias especies de Streptomyces para controlar hongos fitopatógenos (Ling et al., 2020). Las especies de Nocardiopsis ofrecen actividad antifúngica contra especies de Fusarium y producen varios metabolitos antimicrobianos contra diversos fitopatógenos (Intra et al., 2011). Las especies de Streptomyces han demostrado la capacidad de producir sideróforos y su importancia en el biocontrol de fitopatógenos (Zhou et al., 2022).
Resultados similares informaron Al-Dhabi et al. 2019) Las especies de Streptomyces produjeron sideróforos que tenían el potencial de inhibir el crecimiento de fitopatógenos F. Se ha demostrado la capacidad de los actinomicetos para producir COV que presentan actividad antifúngica contra hongos fitopatógenos, estos COV provocan cambios estructurales en la célula de los fitopatógenos (Gong etopatogenes al., 2022). Además, la inhibición de la síntesis de ARNm y proteínas en la célula fúngica resultó de la entrada de quitosano (Ma et al., 2017).
Shagdarova et al. obtuvieron resultados similares. 2021), la aplicación de quitosano inhibió el crecimiento micelial de A. En los últimos años, se ha informado que los actinomicetos aislados de ambientes terrestres son posibles agentes de biocontrol contra fitopatógenos transmitidos por el suelo (Boukaew et al., 2022). Nuestros resultados concuerdan con los informados por Qi et al. 2022), demostró en un experimento in vivo que la cepa de S.
Por otro lado, nuestros resultados también concuerdan con los reportados por Korayem et al. 2020) quienes evaluaron la actividad biológica de la cepa S. Resultados similares a los obtenidos en este trabajo también se demostraron con la aplicación de quitosano como agente de biocontrol, Massoud et al. 2020) demostró que el quitosano (4 g L-1) proporciona actividad de biocontrol contra el marchitamiento de la fresa causado por F.
CONCLUSIONES
LITERATURA CITADA
Biocontrol of rice seedling wilt disease caused by Fusarium oxysporum through soil application of Streptomyces chilikensis RC1830. Influence of chitosan on the early metabolic response of wheat to Fusarium graminearum infection. Foliar application of chitosan increases tomato growth and affects mycorrhization and expression of genes encoding endochitinase.
Study on inhibitory activity and mechanism of chitosan oligosaccharides on Aspergillus Flavus and Aspergillus fumigatus. Effects of chitosan on control of postharvest blue mold decay of apple fruit and the possible mechanisms involved. Inhibition of chitosan with different molecular weights on Barley-Borne Fusarium graminearum during Barley Malting.
Application, mode of action and in vivo activity of chitosan and its micro- and nanoparticles as antimicrobial agents: A review. Comparative efficacy of fungicides and biological controls for managing chickpea wilt caused by Fusarium oxysporum f. The mechanical and biological properties of chitosan scaffolds for tissue regeneration templates are significantly improved by chitosan from Gongronella butleri.
Effects of chitosan treatment on avocado postharvest diseases and expression of phenylalanine ammonia-lyase, chitinase and lipoxygenase genes. Effect of chitosan-poly(acrylic acid) complexes and two nutrient solutions on the growth and yield of two habanero pepper cultivars. Synergistic effect of Trichoderma-derived antifungal metabolites and cell wall-degrading enzymes on improved biocontrol of Fusarium oxysporum f.
Fusarium oxysporum colonizes the stem of resistant tomato plants, with the extent varying depending on the R gene present. Inhibitory effect of chitosan on the growth of the fungal phytopathogen, Sclerotinia sclerotiorum, and Sclerotinia rot of carrot.
ANEXOS
