Me gustaría expresar mi más profundo agradecimiento a todas las personas que fueron fundamentales en la realización de este trabajo de tesis. A todos vosotros dedico este trabajo porque me doy cuenta de que no hubiera sido posible realizarlo de la misma manera sin vuestra presencia constante y apoyo inquebrantable.
INTRODUCCIÓN
Debido a su primordial importancia en ambientes marinos, es crucial determinar cómo la acidificación de los océanos afecta a las microalgas en su metabolismo y por tanto en su fisiología (Basu y Mackey, 2018). En particular, el uso de diatomeas puede permitir evaluar el impacto de estos cambios en los ecosistemas marinos, que incluso pueden tener un efecto en los cambios en la biodiversidad (Feijão et al., 2017).
ANTECEDENTES
Importancia de las algas
- Microalgas
- Diatomeas
Por tanto, pueden actuar como agentes anticancerígenos (Akramiene et al., 2007; Espinoza-Gallardo et al., 2017). La fracción inorgánica que forma la pared celular puede ser del 10 al 50 por ciento del peso seco celular (Hildebrand et al., 2018).
Estrés en microalgas: Homeostasis, aclimatación y adaptación
Las microalgas tienen la capacidad de mantener la homeostasis a través de procesos regulatorios que involucran variaciones metabólicas de corto plazo, sin necesidad de cambios en la expresión genética, lo que resulta en una reducción temporal de la fotosíntesis por cortos períodos de tiempo que van desde segundos a minutos (Raven y Geider, 2003). . Sin embargo, si los cambios creados no pueden alcanzar un nuevo estado de homeostasis, algunos tipos de microalgas tienen estrategias como la formación de quistes y gametos, una mayor producción de pigmentos antioxidantes (p. ej., betacaroteno, luteína y astaxantina, entre otros) y una mayor producción de lípidos. , en el caso de los flagelados (Borowitzka, 2018).
Efectos del incremento de CO 2 atmosférico
- Cambios físicos y químicos en el océano
- Efectos observados del cambio de pH en P. tricornutum y otras microalgas
- Métodos de regulación de pH
Sin embargo, el aumento de CO2 afecta significativamente a las reacciones de conversión de nitrógeno en aguas naturales (Wannicke et al., 2018). Asimismo, están involucrados en la actividad de enzimas, canales iónicos y receptores unidos a membrana (Hashimoto et al., 2018).
Biología de sistemas para el análisis de efecto del pH en diatomeas
- Investigación en biología de sistemas con conjuntos de datos experimentales
- Caso 1
- Caso 2
- Caso 3
- Caso 4
- Metanálisis utilizando conjuntos de datos públicos
- Caso 1. Redes metabólicas de P. tricornutum
- Caso 2. MinOmics, una plataforma para visualizar e integrar datos
- Caso 3. PhaeoNet, un retrato holístico basado en RNA-seq
- Caso 4. Meta-ensamblaje de Novo de transcriptomas
- Herramientas para el análisis de datos en Microalgas
Estos resultados proporcionan información detallada sobre los mecanismos moleculares y las rutas metabólicas utilizadas por las microalgas en la biosíntesis de metabolitos secundarios (Panahi et al., 2020). En la investigación de Morisse et al. 2014), se caracterizó la regulación redox dependiente de tiorredoxina de la fosfoglicerato quinasa cloroplástica, una enzima involucrada en el ciclo de Calvin-Benson. Además, realizaron análisis de expresión diferencial para comparar la respuesta de diferentes módulos a diferentes condiciones experimentales (Ait-Mohamed et al., 2020).
Utilizando diferentes estrategias y herramientas, se realizó una metasíntesis de datos novedosos de RNA-seq y datos públicos (O'Neill et al., 2015; Yoshida et al., 2016; Ebenezer et al., 2019). En el estudio de O'Neill et al. 2015) presentaron la secuenciación de novo y el análisis del transcriptoma de E. Un ejemplo es el guión utilizado en el estudio de Levering et al. 2016), con el que utilizaron sus simulaciones del crecimiento de P.
También incluye la transformación log regular (rlog), un método utilizado en el análisis de datos de RNA-seq para normalizar y estabilizar los datos de expresión génica (Love et al., 2014). ClueGO es un complemento de Cytoscape que visualiza términos biológicos no redundantes para grandes conjuntos de genes en una red funcionalmente agrupada (Bindea et al., 2009). Estas herramientas están incluidas en el paquete SVA (Análisis de variables sustitutas) para RStudio (Zhang et al., 2020).
JUSTIFICACIÓN
En resumen, investigar los efectos de la reducción del pH en el metabolismo de P.
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos particulares
MATERIAL Y MÉTODOS
- Inóculos
- Cepa y medio de cultivo
- Preparación y mantenimiento de inóculos
- Regulación de pH
- Planeación y diseño del sistema de regulación de pH
- Evaluación del desempeño del pH-stat
- Determinación de la eficiencia del pH-Stat
- Determinación del crecimiento y consumo de nutrientes
- Medición de densidad celular
- Medición de nutrientes en el medio de cultivo
- Regresión no lineal para cálculo de parámetros de crecimiento
- Determinación de eficiencia fotosintética
- Caracterización del perfil lipídico
- Análisis de biología de sistemas
Se realizaron diluciones seriadas 1:1 para facilitar el recuento de algunas muestras (Arredondo-Vega et al., 2017). Sin embargo, se fijó un valor mínimo de ajuste de 0 para evitar valores negativos, que no tendrían sentido en la práctica (Queiroz et al., 2011). La eficiencia fotosintética se determinó utilizando la pendiente derivada del gráfico de tempo de producción de O2 en función de la PPFD (Masojídek et al., 2013).
Los lípidos se extrajeron de 20 mg de biomasa previamente liofilizada utilizando una mezcla de metanol y cloroformo (Arjona et al., 2008). Finalmente, los ésteres metílicos resultantes de esta reacción se cuantificaron mediante cromatografía de gases (Palacios et al., 2005; Arjona et al., 2008). Las secuencias de baja calidad fueron recortadas y/o filtradas con el software Trimmomatic (Bolger et al., 2014), usando los parámetros: líder=3, final=3, ventana deslizante=4:15, recorte=120 y minlen= 120.
El mapeo de las secuencias preprocesadas se realizó utilizando el software tophat (Kim et al., 2013) para alinear las lecturas de RNA-seq con el genoma de referencia para identificar las uniones exón-exón. Esta matriz fue procesada para eliminar el “efecto lote” con el programa ComBat_seq (Zhang et al., 2020). En segundo lugar, se realizó un análisis de la vía metabólica, identificando las 30 vías más importantes utilizando el método de análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (Subramanian et al., 2005).
RESULTADOS
- Diseño final y evaluación del pH-stat
- Detalles de diseño y funcionamiento
- Eficiencia en la regulación de pH
- Cambios en crecimiento y consumo de nutrientes
- Crecimiento celular
- Eficiencia fotosintética
- Consumo de nitrato
- Consumo de fosfato
- Consumo de fierro
- Consumo de silicato
- Perfiles de ácidos grasos
- Expresión diferencial de genes
- Análisis clúster y PCA para agrupación de los SRA por pH
- Identificación de DEGs y rutas metabólicas enriquecidas
Sin embargo, se encontró que el punto de ajuste de pH de 7,8 tenía un valor significativamente mayor (p < 0,05) del parámetro Sf en comparación con el punto de ajuste de pH de 8,1 (Tabla 5). Al comparar los parámetros calculados con el modelo, se encontró que el punto de control de pH 8.1 tiene el valor de λ más bajo con una diferencia significativa (p < 0.05) del 54%. Además, es importante resaltar la diferencia en las concentraciones iniciales de nitrato, donde se observó una mayor concentración en el punto de control de pH 7,8, con una diferencia de 27,94% (Figura 18).
No se observaron diferencias significativas (p > 0.05) en los valores de k de este nutriente entre los puntos de control (Cuadro 7). Al consumir este compuesto se observaron diferencias en el patrón de los diferentes puntos reguladores: a pH 8,1 se consumía el 36% de los fosfatos disponibles, mientras que a pH 7,8 se consumían por completo (Fig. 19). Se observaron cambios en las tendencias del consumo, especialmente en el punto de control de pH 7,8, donde el λ para el consumo de hierro fue prácticamente inexistente.
La cantidad de hierro consumido para el punto de control de pH de 7,8 fue de 4,45 µM, lo que representó el 44,30% del hierro disponible. Las barras representan las medias (n=3) y las líneas horizontales la desviación estándar; El * representa diferencias significativas entre los dos puntos de control de pH. No se identificaron diferencias significativas (p > 0,05) en su porcentaje, pero se observó una tendencia a ser menor a pH 7,8 (Fig. 23).
DISCUSIÓN
- Evaluación del pH-stat
- Efectos en el crecimiento, fotosíntesis y consumo de nutrientes
- Efectos del cambio de pH en el perfil de ácidos grasos
- Enriquecimiento de rutas metabólicas
En el presente estudio, este modelo también se utilizó para describir el consumo de silicato y hierro utilizando la diatomea P. En general, los modelos de regresión obtenidos tuvieron un buen ajuste, con valores de R2 cercanos o superiores a 0,8, con excepción de del caso de los silicatos. En el presente estudio, se observó que el parámetro µ era mayor en los cultivos de P. Considerando el papel fundamental del nitrógeno en el metabolismo de las diatomeas (Orefice et al., 2019), se esperaba que su consumo estuviera estrechamente relacionado con la densidad celular, como se refleja en los parámetros λ y µ de estas dos variables, que eran muy similares (Tabla 5 ; Tabla 6).
Aunque en este caso no hubo cambios significativos en μ, se observó un cambio en el consumo total de fosfato y en la duración de la fase exponencial, que alcanzó su agotamiento en el punto de control de pH de 7,8. Sin embargo, teniendo en cuenta que el fósforo participa en reacciones del metabolismo energético (Orefice et al., 2019), es posible que esta diferencia en el consumo neto esté relacionada con el aumento de la tasa fotosintética y una mayor demanda energética requerida para lograr una aclimatación exitosa. como se ha observado en otras microalgas que han logrado adaptarse a condiciones que afectan su homeostasis (Vrana et al., 2023). El aumento observado en los AGS de P. tricornutum coincide con lo reportado por Song et al. 2014) y sigue la tendencia discutida por Spilling et al. 2013), quienes encontraron un aumento en estos ácidos grasos en condiciones de pH más ácidos, como en el caso del punto de control de pH de 7,8.
Este aumento puede estar relacionado con una reducción en la fluidez de la membrana, con el objetivo de reducir el transporte pasivo de iones H+, que aumenta en el medio debido al pH ácido (Bienert et al., 2006). Sin embargo, se observó una tendencia a disminuir los MUFA en el punto de regulación del pH de 7,8, lo que respalda aún más la idea de que P. Se ha observado que estas funciones pueden ser claves en el control fisiológico de la aclimatación de las diatomeas (Tan et al. . ., 2020), que es complementario en la regulación de las funciones enriquecidas de “actividad del factor de transcripción de unión al ADN” y “empalme de ARN”.
CONCLUSIONES
Finalmente, la acidificación de los océanos podría tener consecuencias negativas para la cadena alimentaria marina debido a la reducción de ácidos grasos insaturados en las microalgas. Sin embargo, dada la diversidad de especies en las comunidades de fitoplancton, es probable que existan otras especies con estrategias óptimas de adaptación a condiciones acidificantes.
LITERATURA CITADA
The hyperpolarization of the chara membrane at high pH: effects of external potassium, internal pH and DCCD. Breeding study of the marine microalga Picochlorum oculatum and outdoor deployment in a new bioreactor for high-density production of algal cell mass. Metabolic engineering of Phaeodactylum tricornutum for the enhanced accumulation of long-chain omega-3 polyunsaturated fatty acids.
A possible role for epigenetic processes in the adaptation response to elevated pCO2 in the model diatom Phaeodactylum tricornutum. Integrated regulatory and metabolic networks of the marine diatom Phaeodactylum tricornutum predict response to increased CO2 levels. Physiological and molecular analysis of carbon source replenishment and lipid accumulation induced by pH stress in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum.
Phylogenetic analysis and a review of the history of the adventitious phytoplankter, Phaeodactylum tricornutum Bohlin (Bacillariophyta). Transcriptional orchestration of the global cellular response of a model pennate diatom to share light cycle under iron limitation. accumulation properties of microalga Phaeodactylum tricornutum under different gas liquid ratios. Precessional cycles of the El Niño/Southern Oscillation-like system controlled by Pacific stratification.
ANEXOS
