T E S I S Maestro en Ciencias

The SA signaling pathway positively regulates the expression of the NPR1, PR1 and PR4 genes. On the other hand, several markers related to the phases of the infection cycle of the pathogen were also studied, where Hmp1, NPP1 and CDC14 are associated with different stages of the infection.

INTRODUCCIÓN

Los mecanismos de defensa en respuesta al reconocimiento de algunos patógenos ocurren a través de un complejo sistema de señalización celular que genera una gran cantidad de cambios metabólicos y morfológicos en las plantas y la expresión de genes de resistencia. La modulación de la respuesta de defensa depende del estilo de infección del patógeno.

ANTECEDENTES

Generales

Estudios recientes han incluido inductores químicos para estudiar mecanismos de defensa contra patógenos hemibiotróficos complejos (Halim et al., 2007; Núñez-Pastrana et al., 2011); Se ha observado que la aplicación de MeJA a camelia, sésamo y papa reduce las lesiones necrotróficas contra patógenos hemibiotróficos (Chowdhury et al., 2017; Kondratev et al., 2020; Arévalo-Marín et al., 2021). Debido a la complejidad de los mecanismos de defensa de las plantas frente a un patógeno, un análisis correspondiente a la expresión de genes que forman parte de dicha respuesta puede ayudar a comprender en detalle qué inductores tienen efecto sobre la resistencia de las plantas al patógeno. y los genes que se expresan como consecuencia.

Antecedentes del objetivo particular 1

Problemáticas asociadas a la producción de cultivos
Oomicetos
Phytophthora capsici y sus diversos hospederos
Phytophthora capsici y el género Capsicum

Este aspecto se considera una parte importante de la capacidad del patógeno para atacar a varios grupos de huéspedes (Barchenger et al., 2018). También se evaluó el fenotipo de la enfermedad asociada con la virulencia del chile de P..

Antecedentes del objetivo particular 2

La respuesta de defensa de la planta se induce al reconocer elementos del patógeno
Los mecanismos de defensa en plantas son altamente regulados
Respuestas de tipo compatible e incompatible
Los inductores químicos como elementos para activar la defensa en plantas

El papel del ácido salicílico en la defensa contra patógenos ha sido ampliamente estudiado; esta molécula fue identificada como una molécula de señalización esencial en la respuesta de defensa de la planta. En la vía de señalización de defensa mediada por SA, se ha informado de la expresión de genes como PR1, PR2, PR4 y PR5 (Van Loon et al., 2006).

Antecedentes del objetivo particular 3

Interacciones compatibles con patógenos hemibiotróficos
Inductores químicos inducen tolerancia en interacciones de tipo compatible contra
Efecto de inductores químicos sobre la tolerancia de Capsicum a patógenos

Halim y colaboradores, donde presentaron evidencia vinculada a la importancia del ácido salicílico en la defensa basal de la planta de papa (Solanum tuberosum) contra el oomiceto P. También se estableció que este estado inducido podría transmitirse a la descendencia de la planta.

JUSTIFICACIÓN

Importancia Científica

Importancia Tecnológica

Importancia para el desarrollo nacional y mundial

Pertinencia Económica
Pertinencia Ambiental
Pertinencia Social

La marchitez del chile es la principal causa de pérdida de cultivos de chile en el mundo y se considera un factor ambiental importante que afecta negativamente el desarrollo de estos cultivos. Por ello, es importante evaluar su interacción, para desarrollar estrategias que eviten pérdidas mayores. se genera en los diferentes tipos de chile que se producen. La producción de chile tiene un alto valor sociocultural en el país, su uso muchas veces se asocia con la gastronomía, y debido a la gran variedad de variedades de chile que se encuentran en el país, México ha sido premiado como una de las regiones con mayor importancia. en esta área. . La investigación de cómo algunos efectores pueden influir en el desarrollo de la marchitez del chile es importante en este sentido, sobre todo porque afecta muy gravemente a varios tipos de chile, y dentro de las variedades conocidas solo existe una variedad récord en el país. que muestra tolerancia a dicha enfermedad, por lo que se considera una especie de chile muy importante para el estudio de esta enfermedad.

En 2014, el país tiene una de las mayores disponibilidades energéticas del mundo, cuantificada en 3.145 kilocalorías por persona y día.

HIPOTESIS

OBJETIVOS

Objetivo general

Objetivos particulares

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de material biológico (aplica en todos los objetivos)

Obtención de plántulas in vitro
Preparación del patógeno

Material y métodos para cubrir el objetivo particular 1

Análisis de patogenicidad con escala de severidad
Detección de los genes de fase infectiva por RT-PCR

Tratamiento químico con inductores
Extracción de ARN total de tejido vegetal
Cuantificación de marcadores de defensa por RT-qPCR

Infección de las plantas de chile previamente tratados con inductores químicos para
Análisis a nivel macroscópico
Análisis de marcadores de defensa y de fases infectivas por RT-PCR en plantas
Análisis estadístico

Porcentaje del índice de enfermedad = (el grado numérico de la enfermedad X número de plantas enfermas de ese grado) / (el grado más alto de la enfermedad x el número total de sobrevivientes) En total se utilizó PureZOL de la empresa comercial BIO-RAD. Para el análisis del efecto de la molécula inductora sobre el ciclo infectivo de P. capsici en Capsicum spp. Se desarrollaron 2 estrategias.

En la segunda estrategia, se trataron plantas de 4 semanas de edad con 2 ml de una solución de la concentración analizada de la correspondiente molécula inductora, la caja magenta.

RESULTADOS

Determinación del grado de virulencia de P. capsici sobre Capsicum spp

Análisis de virulencia a nivel macroscópico con inoculo Zoosporas P. capsici

En el análisis de virulencia de la cepa Veracruz se tomó como hospedante la variedad Chiapas, los síntomas aparecieron a las 24 horas, sin embargo, afectaron en menor medida a las plantas, se observó necrosis con un ligero color marrón (Cuadro 6). Efecto de la reinoculación con zoosporas a 96 hpi (15 y 20 µl), para las variedades Chiapas (CcC) y Mayan Ba'alche (CcMB). La presencia de síntomas a las 24 horas de la inoculación en las poblaciones de las cuatro variedades de Capsicum spp. observado; Durante el curso de la infección, se presentaron los síntomas descritos para la enfermedad del marchitamiento del chile, como se observa en la Tabla 9.

Puntuación del análisis de progresión de la enfermedad evaluada cada 24 horas después de la infección con P.

Análisis del efecto de elicitores sobre marcadores de defensa en planta

Evaluación del efecto de la concentración de los elicitores moduladores de la

En el caso de BABA, que se evaluó a una concentración de solo 2,5 mM, este mostró un aumento en la expresión en todos los genes evaluados (Fig. Para cada gen, en el caso de NPR 1 para ET hubo un aumento en la expresión de 2,75 y 1,49 para concentraciones de 0,1 mM y 2,5 mM, respectivamente, mientras que la concentración de 1 mM reprimió la expresión génica -2,35 veces; en el caso de SA, se observó un aumento de 2,8 en la expresión para la concentración de 2,5 mM, mientras que para 1 mM y 5 mM hubo una represión de -1.53 y -2.25 veces respectivamente; con MeJA 0.15 mM no hubo cambios en la expresión para el pretratamiento con tiempo de aclimatación de 24 horas “MeJA (24)”, mientras que para el tiempo de aclimatación de 72 horas se suprimió - 2.4 veces, en el caso de BABA hubo un aumento en la expresión de 3.24 veces (Fig. 4A), finalmente para el marcador PDF1.2B en ET dio un aumento en la expresión de 5.16, para la concentración 1 mM el resto de las concentraciones fueron suprimidas, con SA se observó un aumento de 2.57 a 2.5 mM, mientras que para 1 mM no hubo cambios y para 5 mM el gen se suprimió -5.33 veces, Sen MeJA. La expresión aumentó para MeJA (24), MeJA (72) no mostró cambios, finalmente BABA mostró un aumento de 2,4 veces.

Estos resultados indican que concentraciones de SA 2.5 mM, ET 1 mM, MeJA 0.15 mM y BABA 2.5 mM activan mecanismos relacionados con la defensa en Capsicum annuum variedad Ancho.

Análisis del efecto de elicitores sobre las fases de infección a nivel macroscópico y

Efecto del tratamiento con SA, ET y BABA en la tolerancia a P. capsici basado en escala
Efecto del tratamiento con Jasmonato de Metilo (MeJA) en la tolerancia a P. capsici

Índice de gravedad de la enfermedad para Capsicum annuum Ancho (CaA) tratado con BABA a las 24, 48 y 72 h después de la infección con P. Para el grupo 2 a las 24 h, los síntomas presentes en el 33% de la población correspondieron a una apariencia acuosa (Tabla 1). ), a los 48 hpi, el 67% de la población tenía esta apariencia húmeda (Escala 1), y el 33% restante tenía lesiones en un área localizada (Escala 2). En este segundo evento, se encontró que en el tratamiento con MeJA 0,15 mM (grupo 2) inoculado 24 h después del tratamiento, la aparición de los síntomas se retrasó ligeramente y no hubo síntomas evidentes durante las primeras 24 hpi en comparación con otros. de los tratamientos en los que aparecieron los primeros síntomas en toda la población, la misma tendencia se presentó en todas las 72 horas posteriores a la infección, donde los síntomas más severos en el grupo 2 fueron necrosis foliar en el 80% de la población (Escala 3), para los grupos 1, 3 and 4 la mayoría de la población presentó síntomas de necrosis del tallo, lo que indica que la infección había alcanzado un nivel sistémico (Figura 10).

Los resultados obtenidos de los perfiles de expresión de los genes HMP1 y NPP1 en el tratamiento con MeJA -24 mostraron un mayor tiempo en la fase biotrófica y un retraso en la

DISCUSIÓN

Discusión sobre el objetivo particular 1

En cuanto al método micelial, al ser evaluado nos permitió realizar una infección consistente, cuyos síntomas fueron homogéneos en una determinada población en diferentes eventos biológicos, presentando una sintomatología más acorde a lo reportado en diversas literaturas como el marchitamiento. chile (Lamour et al., 2012b) (Cuadro 9). El fenotipo característico se observó en interacciones hemibiotróficas, donde el patógeno cambia su estrategia de infección (biotrófica a necrotrófica), lo cual ha sido informado por varios autores (Lamour et al., 2012a; Jupe et al., 2013; Coles et al., 2022). ). ) En la interacción de P. Al realizar el análisis de tolerancia a las 4 variedades de Capsicum mostraron una pequeña diferencia en el grado de tolerancia (Cuadro 10), estos resultados concuerdan con lo observado por Kang y colaboradores (2020) . .

El método de inoculación de micelio ha sido reportado como un método agresivo para la infección por patógenos hemibiotróficos, siendo confiable para evitar falsos positivos en el grado de tolerancia al patógeno bajo análisis (Kondratev et al., 2020).

Discusión sobre el objetivo particular 2

La revisión bibliográfica de experimentos similares realizados por varios autores nos permitió diseñar el experimento para determinar el efecto de las concentraciones de los elicitores BABA y MeJA, teniendo en cuenta la importancia de definir tanto la concentración como el tiempo de aclimatación de la planta al tratamiento. La evaluación de los diferentes tratamientos se realizó a nivel macroscópico debido al efecto del tratamiento en la planta a nivel fisiológico; y a nivel genético, por la expresión relativa de diversos genes relacionados con las vías de señalización asociadas a cada una de las fitohormonas evaluadas. Se observó que concentraciones de SA 2,5 mM, ET 1 mM, MeJA 0,15 mM y BABA 2,5 mM activan mecanismos relacionados con la defensa en Capsicum annuum variedad Ancho.

Estos resultados concuerdan con lo reportado por varios autores sobre plantas del género Capsicum (Núñez-Pastrana et al., 2011; Mishra et al., 2017; Barraza et al., 2022), sugiriendo que se desarrollaron mecanismos de defensa modulados. Para cada una de las fitohormonas analizadas en estas concentraciones, para el resto de las concentraciones evaluadas, la respuesta en la expresión genética no fue tan consistente y llamativa.

Discusión sobre el objetivo particular 3

La evidencia de un efecto en la expresión de genes relacionados con la patogénesis debido a la influencia del inductor en su ciclo infeccioso es nula, pero se ha reportado una comparación de la expresión de genes marcadores del ciclo infeccioso de Phytophthoras de diferentes especies. La expresión del gen RXLR25 del patógeno indica que la respuesta de defensa de la planta está suprimida, por lo que la observación de su mayor expresión en la planta pretratada con MeJA podría significar que previene la activación de la defensa como resultado del pretratamiento. , este efector es crucial en la virulencia de P. Finalmente, se evaluaron genes de defensa de las plantas frente a la infección, comparando la expresión génica en infección simple con infección en plantas pretratadas con MeJA 0,15 mM.

La expresión de los diferentes genes evaluados presenta su punto más alto para el tratamiento con MeJA a las 24 hpt en la mayoría de los casos, esto se observó para los genes NPR1, LOX2, AP2 y WRKY40.

CONCLUSIONES

Conclusión sobre el objetivo particular 1

LITERATURA CITADA

Identification and functional analysis of the NLP-encoding genes of the phytopathogenic oomycete Phytophthora capsici. The CaAP2/ERF064 regulates dual functions in pepper: plant cell death and resistance to Phytophthora capsici. Ethylene, but not salicylic acid or methyl jasmonate, induces a resistance response to Phytophthora capsici in habanero pepper.

Tissue-specific colonization of Capsicum spp. by Phytophthora capsici: molecular insights into plant-pathogen interaction.

ANEXOS

Como resultados, observamos que mediante fraccionamiento por electroforesis de los productos de la PCR en gel de agarosa, los fragmentos característicos de los productos correspondientes fueron de los tamaños correspondientes en pares de bases (Pb) (PcHmp1.- 950 pb, PcNPP1.- 350 pb., PcCDC14. - 490), también se evaluaron los oligonucleótidos del gen de la β-tubulina. Además, se evaluaron los oligonucleótidos CAP (452 pb) utilizados para la cuantificación del ADN del patógeno (Fig. 16). Se determinó que no existe formación de dímeros, lo que indica que el diseño y función de los cebadores es el adecuado. Esto es importante ya que estos cebadores nos permitirán detectar y determinar la fase infecciosa activa en la interacción de P.

Se fraccionaron 3 microlitros del producto de la PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1%.