INTRODUCCIÓN
Importancia de la agricultura en México
La agricultura juega un papel fundamental en el desarrollo de los países, promoviendo recursos tanto para los sectores no agrícolas como generando un mercado importante para productos industriales, permitiendo a los países beneficiarse de su crecimiento (Pérez, 2008). México es uno de los países productores y exportadores de alimentos más importantes del mundo y en los últimos años ha tenido el potencial de producción, las condiciones agroclimáticas, la infraestructura y la disponibilidad para adaptarse a las demandas de los mercados nacionales e internacionales y del sector agrícola y alimentario. sector como uno de los motores más importantes de la economía nacional.
Enfermedades vegetales
Lo anterior confirma que los productos agronómicos mexicanos han logrado un fuerte arraigo en los mercados internacionales (SAGARPA, 2017). Se ha informado que las enfermedades de los cultivos pueden causar una pérdida global anual promedio del 12,3 al 13,3% del rendimiento mundial alcanzable, que, junto con otras causas de disminución del rendimiento, aumenta a una pérdida global anual promedio del 33% al 42%. cosecha agrícola alcanzable (Jiménez, 2017).
Los virus como agentes patógenos que limitan la producción agrícola
Familia Geminiviridae (Geminivirus)
Según su filogenia y la organización de su genoma, los geminivirus se clasifican en dos grandes grupos; los del viejo mundo que se encuentran en Europa, Asia y África, y los virus del nuevo mundo que se encuentran en América. Esta clasificación coincide con el tipo de genoma de los geminivirus, ya que los del viejo mundo pueden ser tanto unipartitos como bipartitos, mientras que los del nuevo mundo solo tienen un genoma bipartito (Huanca y Trejo, 2013).
Características de los Begomovirus
La infección se propaga dentro de la planta mediante el movimiento del ADN viral mediante la proteína de movimiento nuclear (NSP), que transporta el ADN viral desde el núcleo al citoplasma y de una célula infectada a una célula adyacente mediante la proteína de movimiento (MP). otros, 2013). El ADN-A codifica la proteína de iniciación de la replicación (Rep), la proteína activadora de la transcripción (TrAP), la proteína potenciadora de la replicación (Ren) y la proteína de la cápside (CP), mientras que el ADN-B codifica dos proteínas adicionales, la proteína de translocación nuclear (NSP) y la proteína de movimiento. . (MP) (Luna y Lozano, 2020).
Primeros reportes de Begomovirus en México
- Pepper Golden Mosaic Virus (PepGMV)
Estos incluyen la curvatura y distorsión de las hojas, la aparición de patrones moteados o mosaicos amarillos y, a veces, hinchazón de las venas y enanismo (Handley et al., 2013). De estas especies, cinco son las más cultivadas en el mundo, siendo Capsicum annuum la más importante y consumida (Castro et al., 2011).
Importancia de la proteína de replicación (Rep) en la infección viral de Begomovirus
La proteína iniciadora de la replicación REP es una proteína altamente conservada en los geminivirus y comparte muchas similitudes con las proteínas iniciadoras de la replicación en los plásmidos eubacterianos. Es necesario para el inicio, extensión y terminación del proceso de replicación viral y participa en la estimulación de la transcripción.
Mecanismos de defensa de las plantas
La inmunidad activada por patrones (PTI) es capaz de reconocer moléculas altamente conservadas que poseen la mayoría de los microorganismos, como los PAMP o MAMP. ETI, por otro lado, es inmunidad activada por efectores y es capaz de reconocer y responder a factores que causan virulencia llamados "efectores".
Microbioma de las plantas
- La rizósfera
Las bacterias son los microorganismos más numerosos de la rizosfera; gran parte de la superficie total de las raíces está cubierta por bacterias, entre las que se distinguen los géneros Pseudomonas, Bacillus, Arhtrobacter, Rhizobia, Agrobacterium, Alcaligenes, Azobacter, Mycobacterium, Flavomonabacter, Cellu. y Micrococcus (Prashar et al., 2013). Las bacterias promotoras del crecimiento (PGPB) pueden promover el crecimiento directo e indirecto de las plantas.
ANTECEDENTES
Proteínas elicitoras de la respuesta contra patógenos en plantas
Uno de los grandes grupos de proteínas secretadas por Trichoderma son las proteínas ricas en cisteína (SSCPs), entre las que destaca la proteína Ep1, de la que se ha confirmado que actúa como inductora de mecanismos de defensa y juega un papel importante en la interacción entre También se reporta una proteína elicitora aislada del actinomiceto Saccharothrix yanglingensis Hhs.015, denominada BAR 11, que funciona como estimulante de la resistencia sistémica en Arabidopsis thaliana a Pseudomonas syringae pv, y ha demostrado capacidad para inducir las vías del ácido salicílico y del ácido jasmónico. , así como la interacción con catalasas del huésped en células vegetales (Zhang et al., 2017).
Resistencia a partir de secuencias derivadas de patógenos
Efecto de los patógenos en las comunidades microbianas de las plantas
JUSTIFICACIÓN
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos particulares
MATERIAL Y MÉTODOS
- Obtención de cepas bacterianas
- Extracción y análisis de material genético de cepas bacterianas
- Siembra, germinación y crecimiento de plantas de N. benthamiana
- Preparación de células competentes y transformación genética
- Inoculación de plantas por agroinfiltración e infiltración
- Recolección de muestras de tejido foliar y radicular
- Recolección de tejido vegetal foliar
- Recolección de tejido vegetal radicular y rizósfera
- Preparación de las muestras para extracción de ADN
- Extracción de ADN
- Extracción de ARN de tejido foliar
- Síntesis de primera cadena (ADNc)
- Cuantificación de la expresión génica (PCR tiempo real)
- Cuantificación absoluta de genes 16S e ITS (bacteria, archea y fungi)
- Cuantificación absoluta de carga viral
- Secuenciación de nueva generación
Una vez realizada la lisis celular, se tomó 1 ml del sobrenadante obtenido y se transfirió a tubos Eppendorf nuevos de 1,5 ml, a los que se les añadió un volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) a pH 8,0 y se mezcló cuidadosamente. . por inversión. Las muestras se centrifugaron a 12.000 g durante 15 minutos y la fase acuosa se recuperó en tubos Eppendorf de 1,5 ml. La concentración de las muestras de ARN se cuantificó en una nanogota y se añadió 1 µg a nuevos tubos eppendorf de 1,5 ml.
A partir de los datos se realizó la curva de concentración y las muestras de todos los tratamientos se cuantificaron en los 3 puntos de tiempo seleccionados mediante PCR en tiempo real. A partir de los datos obtenidos, la carga viral aproximada de PepGMV presente en las muestras de hojas por gramos calculados.
RESULTADOS
Extracción de ADN de cepas bacterianas y comprobación de la presencia de los plásmidos
Inoculación de PepGMV y desarrollo de síntomas en N. benthamiana
Por otro lado, se realizó extracción de ADN en muestras de hojas con el objetivo de verificar la presencia del virus en plantas infectadas y conocer la carga viral presente en cada momento de la recolección. Luego de obtenido el ADN genómico, a todas las muestras se les realizó la técnica de PCR cuantitativa utilizando el cebador que amplifica la proteína Rep para verificar su presencia en el plásmido. Se observó que la carga viral aumentó significativamente entre 1 y 7 días después de la inoculación y permaneció estable hasta 21 días.
Se encontró que la muestra inoculada con Rep contenía secuencias de proteína Rep muy bajas que no aumentaron con los días posteriores a la inoculación (Fig. 3). Gráficos de comparación de las cargas virales de hojas infectadas para los tres momentos de muestreo en muestras infiltradas con PePGMV y con Rep (barra izquierda: PepGMV, barra derecha: Rep).
Extracción de material genético
- Extracción de ARN de hojas
- Extracción de ADN de raíz y suelo
Una vez recolectadas, las muestras de raíz y suelo se procesaron agregando tampón de lisis para obtener material suficiente para la extracción de ADN bacteriano. La integridad del ADN extraído de las muestras de raíz se comprobó mediante la técnica de electroforesis (Fig. 5) y las muestras se cuantificaron para conocer su concentración y la calidad obtenida (Tabla 4). Las muestras de suelo se procesaron utilizando el sistema de limpieza de ADN Wizard antes de enviarlas para su secuenciación (Fig. 6) (Tabla 5).
Electroforesis en gel de agarosa de ADN genómico de tejido endofítico (raíz) de muestras de control, simuladas y PepGMV (Tabla 4). Electroforesis en gel de agarosa de ADN genómico de la rizosfera para muestras de control, simuladas y PepGMV (Tabla 5).
Análisis de la expresión de genes mediante qPCR
El gen DCL4, por otro lado, no mostró diferencias significativas para ninguno de los tratamientos en los 3 tiempos de muestreo (Fig. 10e). Se observó una diferencia significativa a 7 dpi en PepGMV y en los 3 tiempos con la secuencia Rep. Se observaron diferencias significativas a 1 dpi y 7 dpi en las plantas inoculadas con PepGMV y a 21 dpi en las plantas inoculadas con Rep is.
En las muestras Rep se observa un aumento significativo a 1 y 7 dpi, mientras que a 21 dpi hay una disminución en la expresión. Se observó una diferencia significativa a 1 ppp en PepGMV y en Rep a 1 y 7 ppp. E) DCL4: No se observaron diferencias significativas.
Cuantificación absoluta de comunidades microbianas
Gráficos de comparación de abundancia de bacterias endofíticas en muestras de raíces por gen de ARN 16S. Gráficos de comparación de abundancia de arqueas endofíticas en muestras de raíces por gen de ARN 16S. Gráficos de comparación de abundancia de organismos fúngicos endófitos en muestras de raíces de la región ITS.
Gráficos de comparación de abundancia de bacterias en muestras de rizosfera del gen 16S RRNA. Parcelas de comparación de abundancia de organismos fúngicos en muestras de raíces de la región ITS.
Secuenciación de nueva generación
- Composición de comunidades microbianas asociadas a N. benthamiana durante la
Para las muestras de bacterias endofíticas después de 21 días de tratamiento, la composición bacteriana de las muestras infectadas con PepGMV y las muestras de control y esos modelos estuvo compuesta principalmente por el filo Firmicutes (31,6%), seguido por el grupo Proteobacteria (22,58%) y Actinobacteria (5. 55%) (Fig. 20a), mientras que para Rep la composición más alta fue Fusobacteria (14%), Proteobacteria (14%) y Actinobacteria (9%). El perfil taxonómico de las bacterias de la rizosfera después de 7 días de tratamiento mostró que tanto las muestras infectadas como las muestras de sustrato compartían una composición bacteriana similar, compuesta principalmente por el grupo Firmicutes (57,7%) y Proteobacteria (13,8%), mientras que en las muestras control y modelo tienen predominio del grupo Proteobacteria (22,15%) y Actinobacteria (19,57%), seguido de Firmicutes (17,1%) (Fig. 22a). La familia más abundante en las muestras y sustrato infectados fue Lactobacillaceae (52.61%), ya que en las muestras Rep donde predominó Lactobacillaceae (30%), en cambio, en las muestras control y aquellos modelos sí se encontró.
Después de 21 días de tratamiento, la composición bacteriana de las muestras de rizosfera infectadas con PepGMV mostró un mayor porcentaje de Firmicutes (72%), similar a la de las muestras de sustrato (33%) y control (48,3%). Por otro lado, en las muestras de Rep se observaron las clases Actinobacteria (50%) y Alphaproteobacteria (9%), mientras que fue falso donde.
DISCUSIÓN
Estos resultados indican que la vía de silenciamiento génico se activa en los primeros días tras la inoculación de PepGMV y es la principal responsable de combatir la infección viral en plantas N. Los resultados obtenidos mostraron que en las muestras tomadas del compartimento endofítico hubo una disminución en la abundancia de tres tipos de microorganismos en los primeros días después de la inoculación (Fig. 12, 13 y 14). Sin embargo, 21 días después de la inoculación, la abundancia de las poblaciones se recuperó respecto al control.
Este aumento en la ocurrencia de la rizosfera podría corresponder al fenómeno de reclutamiento de microorganismos en las plantas, donde se ha demostrado que las bacterias beneficiosas pueden enriquecer la microbiota de las plantas enfermas debido a diferente señalización molecular entre la planta y el rizobioma (Gao et al. . ., 2021). De manera similar a los resultados en la rizosfera, se observó un aumento en la abundancia de la microbiota endofítica en las plantas inoculadas con Rep, lo que correspondería a este fenómeno.
CONCLUSIONES
LITERATURA CITADA
Arabidopsis RNA-dependent RNA polymerases and dicer-like proteins in antiviral defense and small interfering RNA biogenesis during Turnip Mosaic Virus infection. Frequent occurrence of recombinants in mixed infections of tomato yellow leaf curl disease-associated begomoviruses. Tomato Yellow Leaf Curl Sardinia Virus Rep-derived resistance to homologous and heterologous geminiviruses occurs through different mechanisms and is overcome when virus-mediated transgene silencing is activated.
Resistencia al geminivirus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate en plantas de Nicotiana benthamiana transformadas con un gen viral C1 truncado. Virus fitopatógenos que afectan el cultivo de chile en México y análisis de técnicas de detección.
ANEXOS
