34 VI.V Establecimiento del diseño experimental 36 VI.VI Detección de transformación genética por actividad. 36 VI.VII Confirmación de transformación por RT-PCR 38 VI.VIII Resolución del diseño del experimento para evaluación.
Características taxonómicas, e importancia económica del crisantemo
II El cultivo in vitro de crisantemo
Mejoramiento genético
Actualmente podemos dividir el mejoramiento genético en dos clases; El primero utiliza la selección mediante cruzamiento y retrocruzamiento como herramienta principal para incorporar o fijar los rasgos deseados en el cultivar. Esto se denomina mejoramiento genético tradicional (Shinoyama et al., 2012) y está limitado por el acervo genético de la especie. entre diferentes especies es generalmente incompatible (Díaz et al., 2010) y ciertas especies no presentan características interesantes en ninguna de sus variedades, por lo que no será posible obtener un híbrido con una característica que no poseen los padres. La segunda clase de mejoramiento genético vegetal se basa en el uso de diferentes métodos biotecnológicos y permite introducir nuevos rasgos que serían imposibles de obtener mediante el mejoramiento genético tradicional (Shinoyama et al., 2012), y aumentar la diversidad genética (Boskovic et al., 2012). ). otros, 2010).
Transformación genética en plantas
Las cepas de Agrobacterium en las que se ha modificado el plásmido Ti y se ha sustituido la secuencia del gen que induce la formación de tumores en plantas por genes de interés son uno de los métodos más eficientes para introducir genes extraños en las plantas (Díaz et al., 2010). Sin embargo, la variedad de especies hospedantes de Agrobacterium aún es incierta y se han reportado casos de infección en numerosas plantas ornamentales como Tricyrtis hirta (Adachi et al., 2005), Gerbera (Hussein et al., 2013), incluido el crisantemo, entre otros. (Miller 1975, Bush y Pueppke 1991; Ogawa et al., 2000).
El proceso de Transformación de Agrobacterium
La importación del complejo T al núcleo requiere transporte activo debido a su tamaño y se produce a través de la maquinaria de transporte de la célula huésped (Figura 3). Enzimas y proteínas que Agrobacterium secuestra para insertar ADN-T en el núcleo y el genoma de la célula huésped.
Modificación de Agrobacterium hacía un sistema para la transformación de plantas
El gen de interés y la región fuente se encuentran en el mismo plásmido; para la introducción del gen de interés en el plásmido Ti se requiere una recombinación previa con un vector de recombinación. A diferencia de los plásmidos cointegrados, que incluyen la región fuente y la región T-DNA en un mismo plásmido, los sistemas binarios no requieren de recombinación previa para construir el casete de expresión (Figura 4), lo que facilita el trabajo de transformación ahorrando tiempo.
Estrategias para la selección de plantas transformadas por Agrobacterium
Al igual que la kanamicina, la higromicina es un aminoglucósido que inhibe la síntesis de péptidos en procariotas y eucariotas, que en este caso interfiere con la subunidad 70S u 80S del ribosoma, pero cuando se fosforila el grupo hidroxilo de la higromicina-B, pierde su capacidad. para unirse a la subunidad ribosomal (Pardo et al., 1985; Sen et al., 2013). Teixeira y Fukai (2002) utilizan como genes reporteros el gen uidA que codifica la enzima β-glucoronidasa (GUS) y el gen gfp que codifica la proteína Green Fluorecent Protein (GFP) para verificar la transformación del crisantemo en diferentes métodos de reintegración.
Principales factores que afectan la transformación in vitro
Concentración de Agrobacterium y tiempo de cocultivo
Los autores concluyen que la inserción de uidA es más estable en el genoma de la planta a medida que se desarrolla, a diferencia de gfp, cuya expresión es transitoria.
Aplicación de Acetosiringona como potenciador de la transformación
Esto sugiere que puede haber una predisposición de los explantes a ser más o menos sensibles a determinados tipos de antibióticos. En crisantemo, los principales antibióticos utilizados para la desinfección de explantes transformados son cefotaxina, carbenicilina y vancomicina. También informaron el efecto fitotóxico para la morfogénesis utilizando cualquiera de los tres antibióticos en concentraciones altas y bajas.
Variedad y tipo de explante empleado para la transformación
Timentin eliminó la bacteria en todo momento (15 días, 30 días, 45 días y 60 días) evitando la contaminación de los explantes, en comparación con la ampicilina, presentando un 87% de los explantes contaminación con A. Los explantes tratados con cefotaxina mostraron un 58% contaminación a los 45 días después del tratamiento, mientras que la carbenicilina no funcionó para eliminar las bacterias a los 0 días. Para la generación de embriones somáticos, la tendencia fue similar entre los antibióticos y en otros estudios, donde a medida que aumenta la concentración de antibióticos, disminuye la capacidad de generar embriones somáticos.
Eficiencias de transformación
A lo largo de la revisión realizada, se observó que los numerosos protocolos de transformación destinados a optimizar la eficiencia de la transformación (Tabla 1) no se propusieron bajo ningún esquema de optimización formal. Aunque la eficiencia de transformación depende de varios factores, los parámetros evaluados para mejorar la eficiencia de transformación son la concentración de las bacterias en el inóculo, el período de cocultivo y. De los parámetros a considerar para la transformación genética, aquellos que se han reportado como más influyentes para lograr la transformación (Concentración de A. tumefaciens, Concentración de acetosiringona y Periodo de cocultivo) están directamente relacionados con la interacción de la célula vegetal con la bacteria, por lo que Este trabajo tiene como objetivo implementar un protocolo de transformación genética para Crisantemo (Dendranthema grandiflora).
Objetivo General
Objetivos Particulares
Vector de transformación utilizado
Transformación de E. coli con el vector de transformación
Luego del choque térmico, se agregaron 300 μL de medio SOC y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación constante a 225 rpm y se llevó a cabo el sembrado en medio de selección para E. Al día siguiente, se seleccionó una colonia y se incubó durante 24 horas. en medio de selección líquido LB enriquecido con 50 mg/l de kanamicina se añadió, con agitación constante a 250 rpm y 37°C, las demás colonias se mantuvieron refrigeradas a 4°C.
Purificación del vector de transformación
Transformación de la cepa A. tumefciens LBA4404 con el vector pBI121
Efecto del antibiótico sobre la viabilidad del callo
Procedimiento para la transformación del callo de crisantemo
Al finalizar el cocultivo se eliminó el callo del medio de cocultivo y se realizaron 2 enjuagues con timentina 250 mg/l y un enjuague con agua esterilizada, el exceso de agua se eliminó con papel absorbente y el callo se cultivó en un medio desinfectante. Al final del período posterior a la desinfección, analizamos la eficiencia de transformación como porcentaje de callos transformados.
Tratamiento histoquímico para detectar la actividad de GUS
Extracción de, ARN y síntesis de cDNA
Para eliminar trazas de EDTA y tampón TurboDnase 1x, se realizaron lavados añadiendo 2 volúmenes de isopropanol para precipitar durante 3 horas y dos lavados con etanol al 70%.
Amplificación de uidA, aphA3’II y act-cr
La segunda fase inició con la desnaturalización del ADN a 94°C durante 1 minuto, luego se procedió a la fase de alineamiento con los oligos durante 2 minutos, donde se mantuvieron las temperaturas de 65°C, 62°C, 59°C, 56°C. fue evaluado. , 53°C, 50°C y 47°C y finalmente el ciclo finaliza con extensión de cadena a 72°C por 2 minutos. La segunda fase inició con la desnaturalización del ADN a 94°C por 1 minuto, luego la fase de alineamiento con los oligos fue por 2 minutos, donde se alcanzaron temperaturas de 58°C, 56°C, 54°C, 52°C. evaluado. , 51°C, 50°C y 48°C y finalmente el ciclo finalizó con extensión de cadena a 72°C durante 2 minutos. Para la amplificación de act-cr, la primera fase se inició con un ciclo de desnaturalización del ADN a 95°C durante 3 minutos, luego la segunda fase, que consta de 25 ciclos, se inició con la desnaturalización del ADN a 94°C durante un minuto. , seguido de una fase de alineación a 60°C durante dos minutos y finalmente extensión a 72°C durante 2 minutos.
Análisis estadístico de la transformación de los callos de crisantemo
La condición térmica final para la amplificación consistió en una técnica de touch-down, en la que se inició un ciclo a 94°C durante un minuto para la desnaturalización, seguido de 65°C durante dos minutos para el alineamiento de los oligos y finalmente dos minutos a 72°. C durante la extensión, los ciclos posteriores durante el alineamiento de los oligos disminuyeron 1°C, hasta 58°C, y luego pasaron a la etapa de amplificación del producto alineado durante el touch dow, donde se realizaron 35 ciclos que comenzaron en 94°C durante la desnaturalización durante un minuto, seguido por la etapa de recocido a 58°C durante 2 minutos y finalmente se cambió a 72°C durante la extensión durante 2 minutos. La condición térmica final para la amplificación consistió en una técnica de touch-down, en la que se inicia un ciclo a 94°C durante un minuto para la desnaturalización, seguido de 58°C durante dos minutos para el alineamiento de los oligos y finalmente dos minutos a 72°. C durante la extensión, los ciclos posteriores disminuyeron 1°C durante el alineamiento de los oligos, hasta 50°C, para luego pasar a la etapa de amplificación del producto alineado durante el touch dow, donde se realizaron 35 ciclos que iniciaron en 94°C durante la desnaturalización durante un minuto, seguido por la etapa de hibridación a 54°C durante 2 minutos y finalmente se cambió a 72°C durante la extensión durante 2 minutos. Para terminar la reacción de PCR, todas las condiciones térmicas evaluadas en uidA, aph3'II y act-cr tuvieron un tercer paso de extensión a 72°C durante 10 min.
Obtención de A. tumefaciens
Incremento del porcentaje de callos fenolizados, del día 0 al día 10 de cultivo en medio CC, con diferentes concentraciones de Timentín. Aunque no existe diferencia estadísticamente significativa respecto a la concentración de 0 µg/ml, Timentín puede tener un efecto fitotóxico sobre el medio de cultivo y provocar necrosis. En el eje x la concentración de Timentín en µg/ml, en el eje y el porcentaje de fenolización del callo por tratamiento.
Establecimiento del diseño experimental
Gráfico promedio que muestra la fenolización del callo en medio CC adicionado con diferentes concentraciones de antibiótico Timentín.
Detección de la transformación genética mediante la actividad de GUS
Estos oxidantes generan estrés oxidativo abiótico en el medio del callo, que responde liberando fenoles, taninos y quinonas para eliminar los radicales libres, provocando una apariencia oscura (Azofeifa 2009, Sharma et al., 2012) y dificultando la visualización del callo. coloración azul. Evaluación de la transformación del callo de crisantemo mediante análisis histoquímico para la detección de GUS. Micromargara sin transformar, sometida a pruebas histoquímicas y almacenada en etanol al 70%, no se aprecia ninguna coloración azul.
Confirmación de la transformación por RT-PCR
El diagrama de Pareto (Gráfico 3) muestra que el factor de concentración de Agrobacterium tiene un efecto significativo en la transformación cuando se encuentra en su nivel más alto, mientras que los demás factores (concentración de acetosiringona y días de cocultivo) no tienen un efecto significativo. Efecto sobre la transformación El análisis de varianza del conjunto experimental (tabla 9) confirma el efecto de la concentración de Agrobacterium, pero también nos muestra un efecto de los bloques sobre la transformación Amplificación de GUS, NPTII y Actina a partir de ADNc de un callo de tratamiento 5. A ) M) Marcador molecular, 1) control positivo GUS de ADN plasmídico, 2) control negativo GUS, 3) fragmento amplificado GUS de ADNc, 4) control positivo de NPTII a partir de ADN plasmídico, 5) control negativo de NPTII, 6) Fragmento amplificado de NPTII a partir de ADNc, 7) Control positivo de actina, amplificado a partir de ADN genómico, 8) Control negativo de actina, 9) Fragmento de actina amplificado a partir de ADNc.
De los tres factores evaluados, el único que mostró un efecto estadísticamente significativo fue la concentración de A. Los resultados de los tratamientos 1 y 6 concuerdan con los obtenidos por Shinoyama (2002) de 13.6% en eficiencia, utilizando una concentración de Agrobacterium de D.O. 600 = 0,1 y explantes de callo de crisantemo var. Los tratamientos utilizados en este trabajo utilizando una concentración de Agrobacterium de DO600 = 1 y acetosiringona 100 μM fueron los números: 3 y 7, con 3 días de cocultivo para el tratamiento 3 y 1 día para el tratamiento 7, en los cuales 8.3% y 16.6% de transformación La eficiencia se obtuvo respectivamente.
Interacción no significativa entre la concentración de acetosiringona (μM) y los días de cocultivo, favoreciéndose la transformación a una concentración de acetosiringona de 100 μM en 1 día de cocultivo. 1.- Se encontró que una concentración de 250 µg/ml de Timentín es adecuada para la desinfección de Agrobacterium en callos de crisantemo transformados.
ANEXOS
