Análisis de expresión relativa mediante la técnica qPCR de genes implicados en la síntesis de proteínas del estrés. Resumen de los resultados del análisis estadístico a posteriori mediante la prueba de Tukey para el análisis de expresión de algunos genes implicados en la síntesis de proteínas de estrés y la regulación de ácidos nucleicos en C.
Introducción
Se han planteado varias hipótesis como posibles causas primarias de muerte, incluida la presencia de un agente tóxico de origen bacteriano o microalga o un cambio fisicoquímico notorio (Malham et al., 2009). Simultáneamente con el inicio de la mortalidad, se produjeron síntomas de proliferación de algas nocivas (FAN) del dinoflagelado desnudo Akashiwo sanguinea (Bricelj et al., 1992).
Antecedentes
Características generales de Crassostrea gigas
Las branquias también cuentan con tejido muscular que permite mantener la circulación de la hemolinfa (sin pigmentos transportadores de oxígeno). La hemolinfa es bombeada por el corazón, que se encuentra en la cavidad pericárdica, junto al músculo abductor.
Pesquería y cultivo de C. gigas
Si bien la explotación de bancos naturales de bivalvos seguirá siendo importante, un gran número de poblaciones naturales se encuentran cerca de los límites máximos sostenibles, situación que puede ser mitigada por la acuicultura, que ofrece una alternativa a la explotación de poblaciones naturales (Álvarez, 2009). . En el año 2000, aproximadamente el 75% de la producción mundial de bivalvos procedía de algún tipo de cultivo, y la tendencia iba a seguir aumentando (FAO, 2008).
Floraciones Algales Nocivas (FAN)
- Toxinas paralizantes (PSP)
- Toxinas diarreicas (DSP)
Una vez que la célula se despolariza adecuadamente, la conformación de la molécula del canal de sodio cambia. La duración del bloqueo del canal está relacionada reversiblemente con la concentración de toxina y depende de la constante de asociación (Mons et al., 1998). Las toxinas PSP forman un grupo de compuestos de tetrahidropurina estrechamente relacionados, que se dividen en 4 subgrupos: 1) carbamato (STX, neoSTX y GNTX1-4); 2) N-sulfo-carbamoilo (GNTX5-6, C1-4); 3) decarbamoílo (dcSXT, dcneoSXT, dcGNTX1-4) y 4) desoxicarbamoílo (doSXT, doneoSXT y doGNTX1); La toxicidad de estas toxinas varía ampliamente, siendo las del grupo de los carbamatos las más tóxicas (FAO, 2005).
Eventos de mareas rojas en México
Los organismos productores de toxina DSP son dinoflagelados de los géneros Dinophysis y Prorocentrum (Bauder et al., 2001). Band-Schmitt, 2003), y se ha identificado la presencia de toxinas paralizantes y diarreicas en moluscos bivalvos de la zona (Sierra-Beltrán et al., 1996; Heredia-Tapia et al., 2002).
Estado de conocimiento de la respuesta molecular de moluscos bivalvos a la
- Gymnodinium catenatum
- Prorocentrum lima
Las ROS actúan como mensajeros secundarios activando la transcripción de genes específicos para proteger a la célula contra compuestos tóxicos inducidos por el estrés (Dahlhoff, 2004; Manduzio et al., 2005). Al caracterizar los niveles de expresión de estos genes en respuesta a la exposición a C.
Genes de interés en la respuesta de exposición de C. gigas a dinoflagelados tóxicos 21
Lamentablemente, se desconoce la naturaleza de muchas interacciones, como por ejemplo el desconocimiento sobre los efectos de la exposición al C. Efecto sinérgico: en este caso, el efecto combinado de dos agentes químicos es mucho mayor que el efecto de la suma de ambos.
Hipótesis
Objetivos
Objetivo general
Objetivos específicos
Materiales y métodos
- Planteamiento de la investigación
- Juveniles de C. gigas
- Microalgas
- Cultivo de dinoflagelados
- Diseño experimental
- Bioensayo de juveniles de 5-6 mm de C. gigas
- Laboratorio Húmedo de Seguridad Biológica
- Extracción y procesamiento del ARN total
- Aislamiento de ARN
- Cuantificación y análisis de integridad del ARN
- Síntesis de ADNc
- Extracción de ADN
- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) análisis semicuantitativo de genes
- Análisis de expresión cuantitativa de genes relacionados con distintas rutas
- Estandarización de qPCR
- Análisis de expresión cuantitativo de genes de proteínas de estrés
- Análisis estadísticos
Para monitorear la expresión de genes específicos mediante RT-PCR y PCR en tiempo real (qPCR), se obtuvieron juveniles de 5 a 6 mm C. Para cada unidad experimental, el cálculo de la tasa de filtración lo realizaron las microalgas en la célula. directamente. una cámara Sedgwick-Rafter, con un microscopio óptico (Lobban et al., 1988). Los productos de la reacción de amplificación se analizaron mediante electroforesis en un sistema submarino (BioRad) en geles de agarosa al 1%/Synergel® en tampón TBE; Las imágenes fueron documentadas en formato digital utilizando un fotodocumentador (UVITEC, UVP Inc. ®, Inglaterra).
La intensidad de las bandas en los geles se analizó mediante análisis densitométrico con el software UVIDOC V.97 para obtener datos numéricos y realizar la estimación semicuantitativa de la tasa de expresión de cada uno de los genes analizados. Por otro lado, se utilizaron como calibrador de comparación muestras que representan la unidad de cambio en la expresión. Para una cuantificación precisa de la cantidad de ADNc en cada muestra (utilizando el algoritmo del sistema de detección), se establecieron tres parámetros: la línea base, el valor umbral y el ciclo umbral (Cq o ciclo de PCR a partir del cual ocurre este umbral).
La variación en la expresión del gen constitutivo 28S se analizó durante toda la duración del bioensayo (240 horas), ya que los resultados mostraron una mínima variación en la expresión de este gen, se utilizó como gen de referencia en qPCR y como gen de expresión. control en análisis RT-PCR.
Resultados
Análisis de las unidades experimentales y determinación de la respuesta de C. gigas
Análisis microscópico (aumento 10x) del agua de las unidades experimentales durante el ensayo biológico A) Formación de pseudoheces de P.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): análisis semicuantitativo de genes
- Extracción y verificación de ARN total
- Síntesis de ADNc
- Análisis de la expresión de genes de respuesta a estrés y de regulación de ácidos
- Contraste de análisis de expresión a exposiciones individualizadas de C. gigas a
- Análisis específico mediante qPCR tiempo real de genes de respuesta a estrés
- Estandarización de reacción de qPCR
- Análisis cuantitativo de expresión mediante qPCR
La tendencia de comportamiento en la expresión génica tuvo que sobreexpresarse hasta las 24 horas, mostrando un pico máximo a las 12 horas (para los tres tratamientos, más claramente para T2). Para T1 se observó un aumento en la tasa de expresión después de 3 h hasta llegar a las 12 h de exposición, luego se observó una disminución en la expresión hasta alcanzar el estado basal. Para el gen HSP70 se observó un efecto de supresión en la tasa de expresión en los tres tratamientos desde el inicio del bioensayo hasta las 72 horas cuando volvió al estado basal de expresión.
Se observó una tendencia de represión en T3, mostrando un aumento en la expresión solo después de 6 horas (pico máximo). En la expresión del gen HSP70 se encontraron diferencias significativas entre tratamientos y control, pero también entre tratamientos (todos con efectos diferentes sobre C. gigas). Para T1, se observó un aumento en la tasa de expresión de 3 h a 24 h, después de lo cual se suprimió después de 72 h.
En T2 hubo un aumento en el nivel de expresión después de 3 horas, después de 6 horas la expresión es similar a la de TC2.
Discusión
Respuesta de C. gigas en la alimentación
Entre los factores químicos implicados, podemos mencionar la presencia de metabolitos secundarios en el fitoplancton (ácidos grasos, pigmentos o toxinas), además de carbohidratos que rodean la superficie de las células de las microalgas, que muchas veces se forman durante la fase estacionaria del crecimiento de las algas. y en respuesta al agotamiento de nutrientes (Pales-Espinosa et al., 2008); Sin embargo, aún no se ha dilucidado el mecanismo de selección preingestiva (Tran et al., 2010). El uso de técnicas histológicas e imágenes de microscopía electrónica (combinadas con endoscopia) permitió la observación in vivo de las branquias de mejillones como Mulinia edulis y Mytilus chilensis, lo que contribuyó significativamente a la comprensión de los aspectos básicos del funcionamiento del aparato filtrante. mejillones (Garrido et al., 2012). Las especies de bivalvos resistentes son insensibles a las toxinas PSP y no cambian su actividad filtrante ni muestran cierre diferencial de válvulas, lo que permite la acumulación indiscriminada de toxinas en los tejidos (Bricelj et al., 1991).
La toxina (PSP) probablemente no esté directamente involucrada en la respuesta alimentaria inicial observada en las ostras, ya que como lo demuestran Wildish et al. gigas a dos cepas de Alexandrium pp. una tóxica y otra no) las ostras respondieron de manera similar cuando se expusieron a las células, por lo que no se puede generalizar. Se ha demostrado que la producción de pseudoheces es un mecanismo especial de preingesta muy importante, ya que no sólo evita que se supere la capacidad de ingestión de los bivalvos, sino que también facilita el proceso de selección de partículas, en el que se eliminan los materiales menos nutritivos o peligrosos. son rechazados, aumentando la calidad del material que será ingerido (Newell y Jordan, 1983; Urrutia et al., 2001). En las células, la regulación de la fosforilación de proteínas es un paso crítico para mantener la homeostasis celular, ya que están involucradas en numerosos procesos biológicos como el metabolismo del glucógeno, la regulación del ciclo celular, la contracción del músculo liso y la síntesis de proteínas, entre muchos otros (Maynes et al., 2001).
Finalmente, se han sugerido varios mecanismos enzimáticos, así como la agregación y encapsulación por hemocitos (Galimany et al., 2008). Sin embargo, los mecanismos moleculares y metabólicos involucrados aún no se comprenden completamente.
Expresión génica
Las ROS juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis en células y tejidos, activando así la proliferación celular y la respuesta inmune e inflamatoria. Esta pérdida en la modulación de GS coincide con lo observado por Romero-Geraldo y Hernández-Saavedra, (2012) y García-Lagunas y Hernández-Saavedra (datos no publicados), cuyos resultados revelaron una desregulación de la expresión de GS en una exposición individualizada a P después de 6 horas. . Además, se ha demostrado que la OA causa reducciones significativas en la reparación del ADN, la viabilidad celular (Chowdhury et al., 2005) y defectos en los puntos de control críticos de la división celular (Carlessi et al., 2010).
El antagonismo observado puede deberse a factores como la modificación en el comportamiento de filtración (disminución del consumo) o la modulación genética generada por los dinoflagelados. En el caso del T2, el comportamiento observado fue opuesto entre ambos métodos, pero sin alejarse de la línea base. En HSP70 se observa una tendencia a suprimir la expresión de T1, coincidiendo en ambos métodos.
Cabe destacar que ambos análisis muestran que a las 24 y 72 horas para T2 y T3 la tendencia de expresión es.
Conclusiones
En general, se observó una respuesta de modulación en todos los genes analizados en la fase aguda (24 horas). Sin embargo, en la fase subcrónica, se observó que la expresión de estos genes se aproximaba a la línea base del tratamiento control, lo que puede indicar que C.
Bibliografía
Viability of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima after ingestion and intestinal passage in the laurel shell Argopectenirridians. Use of encapsulated live microalgae to investigate pre-incorporation selection in the oyster Crassostrea gigas. Effects of the toxic dinoflagellate Gymnodinium catenatum on the uptake and fate of paralytic shellfish poisons in the Pacific giant lion's paw clam Nodipecten subnodosus.
Changes in gene expression in the Pacific seabass Crassostrea gigas in response to acute exposure to Gymnodinium catenatum. Relationship between valve activity, aquatic microalgae concentration and toxin accumulation in the digestive gland of the Pacific oyster Crassostrea gigas exposed to Alexandrium minutum. Intracellular effects of Okadaic acid in the mussel Mytilus edulis and the rainbow trout Oncorhyncus mykiss.
Functional profiles of hemocytes in the biodefense process of the Pacific oyster, Crassostrea gigas.
