Alineamiento de la secuencia del gen CP de VMAP de Michoacán con otras secuencias reportadas similares………. Alineamiento de la secuencia del gen CP Jalisco VMAP con otras secuencias reportadas similares……….
INTRODUCCIÓN
ANTECEDENTES
Papaya
- Taxonomía
- Descripción
- Origen y distribución
- Mejoramiento genético de la papaya
Las plantas transgénicas de la línea 55-1 (Sunset) que expresan un gen de proteína de cápside única (CP) de una cepa atenuada de VMAP de Hawaii solo fueron resistentes a los aislados de VMAP de Hawaii. Se obtuvieron dos cultivares transgénicos de la línea 55-1, SunUp, que es homocigótica para el gen CP; y Rainbow, hemocigoto para el gen CP, un híbrido de SunUp y el cultivar no transgénico Kapoho (Tennant, 2001).
Virus de la Mancha Anular de la Papaya
- Historia de la enfermedad
- Biología del virus
- Epidemiología
- Diagnóstico del Virus
Se han propuesto métodos para detectar el virus de la mancha anular mediante ELISA "DAS". Por otro lado, Ruiz-Castro et al., (1997) publicaron la técnica RT-PCR para la detección del virus de la mancha anular de la papaya en diversos aislados de muestras de Veracruz, Tabasco y Chiapas.
JUSTIFICACIÓN
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
OBJETIVO GENERAL
Objetivos específicos
HIPÓTESIS
FUNDAMENTACIÓN
METODOLOGÍA
- Sitios de Muestreo
- Plantación comercial de Jalisco
- Campo Experimental “Valle de Apatzingán” del Instituto Nacional de
- Muestreo
- Evaluación de la incidencia y severidad
- Selección de iniciadores para amplificar el gen de la CP del VMAP
- Extracción de ARN
- Electroforesis para comprobar la calidad de ARN
- Tratamiento con DNasa I
- PCR Punto final
- Electroforesis para muestras de ADN
- Recuperación de ADN del gel de electroforesis
- Secuenciación
- Análisis de las secuencias del VMAP de Michoacán y Jalisco
- Diseño, síntesis y evaluación de iniciadores, sondas y estándares de ADN
- Curva estándar para cuantificación del virus
- PCR Transcripción Reversa
- PCR Tiempo Real
- Evaluación de resultados
Áreas amarillas muy ligeramente moteadas que cubren del 1 al 5% del área foliar, con algunos zumbidos en las hojas, pero sin síntomas perceptibles en la hoja. 3 6-15 Áreas amarillas muy ligeramente moteadas que cubren del 6 al 25% del área foliar, con algunos anillos en las hojas, pero sin síntomas perceptibles en la hoja. 5 26-35 Muy ligeramente moteadas, las áreas amarillas cubren el 26-50% del área foliar, los anillos del fruto son lisos, sin magulladuras ni estrías en los pecíolos ni en los tallos.
Donde: IE= Índice de Enfermedad (%); a= número total de plantas en cada paso de la escala; b=. Las amplificaciones por PCR del gen VMAP CP de muestras de Jalisco y Michoacán se enviaron a Macrogen USA Corp. para su secuenciación.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Muestreo
- Michoacán
- Jalisco
Amplificación de los genes de la CP del VMAP
Líneas: a, f y k escalera de 1kb; b, g y l Sin control de ganancia (NTC); cyd muestran Michoacán y Jalisco con cebadores CP1; muestra h e i de Michoacán y Jalisco con cebadores CP2; muestra m y n de Michoacán y Jalisco con cebadores CP3; muestra de control negativo e, j y o. Como se puede observar, el par de cebadores CP1 (carriles cyd) no amplificó para el gen CP, mientras que para el par CP2 y CP3 (carriles hyi, myn) la amplificación se realizó con aproximadamente 1100 pb para CP2 y alrededor de 900 pb para CP3.
Secuenciación
Análisis de secuencias de aislados de Michoacán y Jalisco
Resultados y Discusiones 41 Como se muestra en la Figura 5, el ecotipo del virus de Michoacán comparte 97% de identidad con un aislado de virus encontrado en Colima con el número de acceso AF309968.1 y con otro aislado de Jalisco con el número de acceso AF19482.1. Por otro lado, en la Figura 6 se muestra que el ecotipo del virus Jalisco comparte 98% de identidad con un aislado de Nayarit con número de acceso AF319487.1. Resultados y Discusiones 42 Las secuencias CIATEJ de Michoacán y Jalisco, junto con las 20 seleccionadas, fueron introducidas en el programa UGENE versión 1.17.0 (Unipro, Rusia) y se realizó un alineamiento para observar variaciones e identificar los cebadores, sondas y estándar. diseño. secuencias.
Se puede observar en la Figura 7 que las secuencias de Jalisco y Michoacán (delineadas por el recuadro rojo) presentan variaciones de bases entre sí, y también con las otras 20 secuencias seleccionadas (recuadro negro). Secuencias del gen CP del VMAP de Jalisco y Michoacán comparadas con secuencias reportadas del VMAP de diferentes países.
Análisis in silico de las secuencias Michoacán y Jalisco CIATEJ con secuencias
Resultados y Discusiones 43 También se realizó una matriz de porcentaje de identidad o similitud entre las secuencias mexicanas a nivel de aminoácidos (Cuadro 5), en la cual se observó que entre la secuencia CIATEJ de Michoacán y Jalisco existe una similitud del 95%. Matriz de porcentaje de identidad de aminoácidos entre secuencias del gen VMAP CP encontrado en México. Para complementar lo anterior y tener un panorama más gráfico, se realizó un árbol filogenético con las secuencias de aminoácidos (Figura 8), en el cual se puede observar que la secuencia Michoacán-CIATEJ está estrechamente relacionada con las secuencias reportadas de Colima-AF309968. 1.
Se ha observado variación del gen VMAP CP en diferentes partes del mundo, como lo muestra el estudio de Silva-Rosales et al. 2000), donde se observan los porcentajes de identidad entre las secuencias de México con secuencias de Australia, Norteamérica y Asia, presentando los aislados de México un menor porcentaje de identidad en comparación con los de Asia. Resultados y Discusiones 45 secuencia, estas repeticiones están presentes en las secuencias CIATEJ de Michoacán y Jalisco, confirmando que es VMAP.
Diseño de oligos para evaluación de la carga viral con PCR en tiempo real
Evaluación de iniciadores, sondas y estándares para qPCR
Resultados y Discusiones 47 Los estándares sintéticos para los VMAP estimados de Michoacán y Jalisco se muestran en la Figura 11, donde se puede observar que ambos tienen el tamaño esperado de 148 pb y 135 pb. Las líneas: a y b corresponden al estándar sintético de Michoacán; cyd corresponden a una muestra de Michoacán positiva a VMAP; muestra blanca; marcador molecular f y g de 50 pb; h e i corresponden al estándar sintético de Jalisco; j y k corresponden a una muestra de Jalisco positiva a VMAP; Señala el blanco. La curva estándar de prueba se realizó con una muestra de Michoacán positiva a VMAP, y se muestra en la figura 12, esta curva arrojó un R2 de 0.996, una pendiente de -3.497 y una eficiencia de 93.161%, por lo que se considera aceptable.
En cuanto a la prueba de eficiencia, la combinación de cebadores 0,3 µM y sonda 0,1 µM resultó ser la mejor, ya que no se obtuvo señal de amplificación en otras combinaciones. La Figura 13 muestra una curva estándar elaborada con un estándar sintético como muestra y diluciones de concentración conocida del mismo, la cual tuvo una pendiente de -3,24, un R2 de 0,993 y una eficiencia porcentual de 103,527%.
Seguimiento de parámetros físico ambientales
El mes de marzo, cuando se registró el fenómeno meteorológico que dañó la plantación, tiene una temperatura promedio de 19°C. El registro completo de este mes se puede encontrar en el Apéndice 4. En el Cuadro 8 se registran los datos de algunos parámetros. Evaluado en la estación climatológica del campo experimental “Valle de Apatzingán” durante el 12 al 16 de marzo de 2015, se puede observar que la temperatura mínima varió entre 13.6 y 18.7, además el 14 de marzo se registraron 69.87 mm de lluvia y vientos entre 0,8 y 2,60 m/s. Resultados y Discusiones 52 Durante este fenómeno se perdieron algunas plantas de diferentes líneas, el registro se muestra en la Tabla 9.
La temperatura juega un papel muy importante en el crecimiento de las plantas; y esto afecta simultáneamente el movimiento de los virus y la concentración de cada célula infectada, lo que explica que la aparición de síntomas no siempre se corresponda con las altas concentraciones de los virus (Gibbs y Harrison, 1976). Resultados y Discusiones 53 Vasconcellea cauliflora es una especie que posee genes que le confieren tolerancia contra VMAP, pero en el estudio antes mencionado se menciona que la planta puede mostrar susceptibilidad al virus en condiciones de altas temperaturas.
Frutos obtenidos en las líneas de papaya del “Valle de Apatzingán”
En este caso de estudio las plantas de papaya estuvieron expuestas a cambios de temperatura, ya que en Michoacán hubo altas y bajas temperaturas en 2014 y 2015, las cuales afectaron la plantación, entonces es posible asociar la presencia de enfermedades en plantas tolerantes a factores ambientales como como p.e. temperatura, lo que provoca sensibilidad en las plantas, junto con la presencia de varios vectores en los ecosistemas de Michoacán que transmiten VMAP. Resultados y Discusiones 54 Maradol tiene el potencial genético para producir 108 frutos de 2 kg por planta durante su vida productiva (Garrido y Reyes, 2001). La variedad Maradol fue evaluada en las condiciones del campo experimental “Las Huastecas”, ubicado en la Carretera Tampico-Mante Km.
55; donde el número de frutos varía anualmente dependiendo del manejo y las condiciones climáticas, con un promedio de 45 frutos por planta durante un ciclo de crecimiento (Vázquez et al., 2010). En este trabajo las líneas que se destacaron por tener al menos una planta con alta producción de frutos fueron Criolla, M4, Chica 2, 89 y 90; La línea 89 tuvo una planta con una producción de 68 frutos, por lo que es importante considerar el material genético de esta planta ya que tiene una buena producción de frutos.
Evaluación de incidencia y severidad
Resultados y Discusiones 55 Respecto a la línea M4, la prevalencia del virus disminuyó de 8 a 7, mientras que la severidad también tuvo una disminución de 4 a 2, respectivamente, a los 97 y 532 días después de la siembra (ddp). Resultados y Discusiones 56 Se realizó una prueba de Kruskal-Wallis para evaluar la gravedad mediana dentro de los genotipos a los 97 dap. Según la tabla 12, el valor P es menor a 0.05, por lo tanto existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medianas entre un grupo y otro con un nivel de confianza del 95%. Además, se realizó una prueba de Kruskal-Wallis para evaluar la mediana de severidad dentro de los genotipos a los 532 ddp. Según la tabla 13, el valor P es inferior a 0,05, por lo que existe una diferencia estadística. significativa entre las medianas con un nivel de confianza del 95 %.
Resultados y Discusiones 57 niveles 3 y 2, de igual manera fila 89 el 75% de severidad osciló entre el nivel 3, 2 y 1, comparándolos con Maradol que el 40% de severidad aumentó a 9 en la escala. De manera similar, en este estudio, las líneas Criolla, M4 y 54 fueron clasificadas como moderadamente tolerantes a VMAP, lo que evaluó el índice de enfermedades de las plantas.
Análisis de la carga viral
Carga viral de líneas de papaya muestreadas en el “Valle de Apatzingán” a los 97 ddp y 532 ddp. El análisis de varianza (Tabla 17) muestra que existe una diferencia significativa entre las medias de carga viral entre un genotipo y otro con un nivel de confianza del 95%. El análisis de varianza realizado para la carga viral a los 532 ddp (Tabla 19) muestra que no existe diferencia significativa entre las medias de carga viral entre un genotipo y otro con un nivel de confianza del 95%.
Se observó una disminución de la carga viral (Figura 19) y de la gravedad (Figura 18) entre la primera muestra y la segunda. Esto sugiere que no en todos los casos la recuperación de un fenotipo vegetal es inducida por la disminución de la carga viral.
CONCLUSIONES
Las líneas Maradol y Chica 2 se clasificaron como moderadamente susceptibles según el índice de enfermedad; las líneas Criolla, M4 y 54 fueron moderadamente tolerantes; Las líneas M4, 89 y 90 mostraron grados de resistencia a la enfermedad debido a la disminución de sus cargas virales y la gravedad de sus síntomas. La línea variedad Maradol resultó ser la más susceptible al virus al ser la única que sufrió pérdida de plantas debido a la enfermedad causada por VMAP.
PERSPECTIVAS
BIBLIOGRAFÍA
Virus-resistant papaya plants derived from tissues bombarded with the coat protein gene of papaya ringspot virus. Yellow Krang - A new cultivar of papaya for green consumption with tolerance to papaya ringspot virus. Distribution of Papaya ringspot virus and Papaya mosaic virus in papaya plants (Carica papaya) in Mexico.
Identification and detection of genetically modified papaya resistant to papaya ringspot virus strains in Thailand. Coat protein sequence comparison of South Indian isolates of Papaya ringspot virus with other Indian subcontinent isolates.
ANEXOS
Buffer de Carga para electroforesis de ARN
Electroferogramas de la secuenciación del gen CP del VMAP de
