El objetivo principal de este proyecto de graduación fue encontrar las condiciones adecuadas para obtener la máxima producción de β-fructofuranosidasas a partir de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1; así como el desarrollo de estrategias para el seguimiento de la actividad de β-fructofuranosidasa en la misma levadura. M. participó como estudiante de doctorado en el estudio de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1 para la producción de β-fructofuranosidasas.
INTRODUCCIÓN
17 En México también existe un marcado interés en obtener fructanos de plantas endémicas. Los fructanos de agave son muy importantes para la agroindustria mexicana, específicamente en la producción de tequila, que es una de las bebidas alcohólicas más importantes del mundo en la actualidad [4].
ANTECEDENTES
Levaduras
- Generalidades de las levaduras
Sin embargo, el avance de la tecnología y específicamente el uso de modernas herramientas moleculares ha permitido identificar, comprender y mejorar algunas de las levaduras denominadas no Saccharomyces, también llamadas no convencionales.
Kluyveromyces marxianus ............................................. ¡Error! Marcador no definido
- Metabolismo de Kluyveromyces marxianus
- Crecimiento y termotolerancia de Kluyveromyces marxianus
- Aplicaciones biotecnológicas de Kluyveromyces marxianus
Estudios recientes han buscado avanzar en la comprensión del metabolismo fermentativo respiratorio de las levaduras hemiascomicetos [19]-[22]. La Tabla 2.1 muestra algunos de los parámetros cinéticos informados para varias cepas de Kluyveromyces.
Muchas cepas de hongos, levaduras y bacterias son capaces de producir β-fructofuranosidasas y varias se han cultivado con éxito para la producción de estas enzimas y su posterior extracción, concentración y purificación. Una de las β-fructofuranosidasas más estudiadas es la inulinasa, para cuya producción se utilizan cepas de moho como Aspergillus sp.
Producción de β-fructofuranosidasas en Kluyveromyces marxianus
A continuación se describirán los principales sistemas de cultivo utilizados para la producción de metabolitos.
Sistemas de cultivo
- Sistemas de cultivo en lote (batch)
- Sistemas de cultivo en lote alimentado (fed-batch)
- Sistemas de cultivo en estado continuo
Dependiendo de la configuración de Fe y Fs se pueden proponer tres sistemas de cultivo: discontinuo, discontinuo alimentado y continuo. La Figura 2.8 muestra un esquema de sistemas de cultivo discontinuo, discontinuo y continuo.
Monitoreo de bioprocesos
- Espectroscopia dieléctrica
- Sistema de análisis y conteo de células (CASY ® )
- Sistema de análisis por inyección secuencial (SIA)
32 La Figura 2.7 muestra cómo cambia la concentración de sustrato en estado estacionario en función de la tasa de dilución. Un sistema de análisis de inyección secuencial (SIA) permite solucionar algunas de las limitaciones de los sistemas FIA, como funcionamiento intermitente, consumo de menor cantidad de reactivos, generación de menos residuos, presentando mayor flexibilidad al poder reprogramarse para determinar otras analitos. y requieren menos instrumentos; además de proporcionar control sobre las variables de viscosidad, flujo y temperatura [84].
Optimización estadística de bioprocesos, MSR
38 Cuando se desea optimización en un proceso biotecnológico, MSR es una herramienta poderosa que evita sesgos experimentales y reduce el número de experimentos necesarios [88]. En optimización, MSR es preferible a métodos que perturban una variable a la vez, ya que pueden desperdiciar recursos al realizar una gran cantidad de pruebas.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
JUSTIFICACIÓN
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo principal
Objetivos específicos
METODOLOGÍA
- Microorganismo
- Medios de cultivos
- Banco de trabajo del microorganismo
- Activación de cepa
- Preparación del inóculo
- Preparación del biorreactor e instrumentación
- Técnicas analíticas
- Monitoreo de biomasa
- Consumo de sustrato
- Actividad β-fructofuranosidasa
- Cultivos en lote en biorreactor
- Cultivos en estado continuo en biorreactor
- Cultivos en lote a temperatura óptima
- Cultivos en lote alimentado
- Monitoreo de actividad β-fructofuranosidasa en línea
El perfil de crecimiento se cuantificó mediante el cambio en la absorbancia de las muestras a lo largo del tiempo. El perfil de consumo de sustrato se monitoreó determinando la concentración de azúcares reductores totales en las muestras extraídas del biorreactor. En los casos en que la concentración de azúcares reductores en la muestra era mayor que la de la curva, se diluyó la muestra y se repitió el procedimiento.
Para monitorear la actividad de la β-fructofuranosidasa en línea, se desarrolló una metodología en un sistema de ensayo de inyección secuencial (SIA), cuyo diseño de software y hardware fue desarrollado por Pliego et al dentro de su proyecto doctoral [85]. La Figura 7.2 muestra la configuración y descripción de los componentes del sistema SIA, que fueron utilizados en la implementación de la metodología de monitoreo de la actividad de la fructanasa en línea. El área bajo la curva del gráfico es directamente proporcional a la actividad de la fructanasa.
Después de cada análisis se realizó un ciclo de limpieza para eliminar cualquier rastro de la muestra anterior.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cultivos en lote en biorreactor y pruebas con diferentes fuentes de carbono
- Cultivo en lote con glucosa como fuente de carbono
- Cultivo en lote con fructosa como fuente de carbono
- Cultivo en lote con sacarosa como fuente de carbono
- Cultivo en lote con inulina como fuente de carbono
- Cultivo en lote con fructanos de agave como fuente de carbono
- Comparativa entre actividad enzimática y fuente de carbono
La tabla también muestra que la actividad enzimática no estaba relacionada linealmente con la biomasa cuando se usó glucosa como fuente de carbono, lo que indica que la actividad enzimática está influenciada por factores distintos a la concentración de biomasa. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática para cultivos discontinuos utilizando glucosa como fuente de carbono. De manera similar, la correlación de la actividad enzimática con el crecimiento celular se realizó utilizando todas las técnicas de medición.
Al igual que en los cultivos con glucosa y fructosa, la actividad enzimática no se relaciona proporcionalmente con la biomasa cuando se utiliza sacarosa como fuente de carbono. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática para cultivos discontinuos con sacarosa como fuente de carbono. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática para cultivos discontinuos con inulina como fuente de carbono.
La Figura 8.11 muestra claramente la magnitud de la variación en la actividad enzimática dependiendo de la fuente de carbono utilizada.
Cultivos en estado continuo en biorreactor
- Primer cultivo en continuo
Según la Figura 8.12, la actividad enzimática es máxima cuando la temperatura es 34ºC. De esta forma, el factor que tiene mayor influencia en la actividad enzimática es la tasa de crecimiento específica. De esta forma, es posible recrear las condiciones de disponibilidad de glucosa que se dan durante los cultivos con inulina y AG, con el consiguiente aumento significativo de la actividad fructanasa.
No se encontró ningún tipo de correlación entre el resto de parámetros monitorizados, mostrados en el Apéndice A, con la actividad enzimática. La Figura 8.15 muestra cómo la actividad enzimática se vio afectada por la temperatura a una tasa de crecimiento específica de 0,05 h-1. Finalmente, la actividad enzimática medida en la muestra 4, obtenida en las condiciones de 34 °C y µ = 0,09 h-1, demuestra el fuerte efecto que tiene la disponibilidad de glucosa sobre la actividad de la enzima en cuestión.
También se realizó un segundo cultivo continuo con el objetivo de validar la metodología para el monitoreo en línea de la actividad enzimática utilizando un sistema de análisis de inyección secuencial, cuyos resultados se presentan y discuten en la Sección 8.5.3.
Con el objetivo de explorar la formación de proteasas durante la cinética y verificar el aumento continuo en la producción de β-fructofuranosidasas incluso en condiciones de agotamiento total de la fuente de carbono original, se llevó a cabo un segundo cultivo discontinuo a 34 °C. En este reactor la caída brusca de actividad no se produjo en ningún momento del cultivo; De hecho, a partir de la hora 10, la actividad de la fructanasa comenzó a aumentar de manera constante hasta aprox. Hora 83 y luego cayó ligeramente. Aparte de la variación en la actividad en el cultivo anterior, ambos experimentos tuvieron un comportamiento similar en cuanto a la actividad enzimática.
La Figura 8.18 muestra una mayor actividad en E/ml para el cultivo 2 (6,1 E/ml) que para el cultivo 1 (2,8 E/ml), pero esto se debió a una mayor utilización de biomasa/sustrato debido a una mejor aireación; sin embargo, en términos de U/g de biomasa seca, ambos cultivos tuvieron actividad similar alrededor de la hora 65 (~ 800 U/g). Se dializaron muestras cinéticas representativas y se analizó la actividad de fructanasa para determinar la influencia del sobrenadante en la técnica de ensayo. Donde los autores demostraron que las sales tienen un efecto sobre la coloración de la prueba, lo que afectaría la absorción a 540 nm.
Estos resultados indican algún tipo de interacción entre el sobrenadante y los reactivos de la metodología de determinación de la actividad enzimática; el efecto no se observó en muestras diluidas.
Cultivos en lote alimentado en biorreactor
- Primer cultivo en lote alimentado
- Segundo cultivo en lote alimentado
La Figura 8.21 muestra el desarrollo de la concentración de biomasa durante la fase de alimentación. Esta discrepancia se debe a que la medición de la actividad enzimática en U/ml tiende a depender de la concentración de biomasa; mientras que la medición de la actividad enzimática en U/g responde a la biomasa total en el sistema. Tenga en cuenta que hay poco o ningún aumento en la actividad enzimática después de la hora 13, coincidiendo con una disminución en la saturación de oxígeno.
Con el objetivo de investigar la producción de la enzima de interés a tasas de crecimiento específicas menores a 0.05 h-1, se realizó un segundo cultivo discontinuo donde el flujo de alimentación fue el mínimo posible dado por el sistema de bombeo. La Figura 8.25 muestra la evolución de la concentración de biomasa durante la fase de alimentación. Se observó que a partir de la hora 30 la concentración de biomasa se mantuvo casi constante, lo que indica que la biomasa total no creció linealmente en el tiempo.
Lo cual puede ser el resultado de una menor actividad de fructanasa y/o una mayor producción de proteasa.
Monitoreo en línea de la actividad β-fructofuranosidasa
- Metodología para la curva de calibración en el sistema SIA
- Metodología para la determinación de actividad β-fructofuranosidasa en el sistema
- Monitoreo en línea de la actividad β-fructofuranosidasa de un cultivo en
Protocolo para punto en curva de calibración en SIA Descripción Secuencia Posición. El sistema SIA arrojó una curva de absorbancia versus tiempo en respuesta a la lectura. La Figura 8.29 muestra las curvas generadas por el sistema SIA para cada una de las 5 concentraciones de la curva de calibración.
Para el desarrollo de la metodología para la determinación de la actividad β-fructofuranosidasa en el sistema SIA se utilizaron muestras del primer reactor discontinuo alimentado. La Tabla 8.15 detalla los parámetros programados en el sistema SIA para la muestra en blanco para la cual se determina la actividad de fructanasa. La Tabla 8.16 describe los parámetros programados en el sistema SIA para la determinación de la actividad de β-fructofuranosidasa en una muestra.
La Figura 8.31 muestra las curvas de respuesta que se crearon utilizando la metodología para determinar la actividad de fructanasa desarrollada en el sistema SIA.
CONCLUSIONES
PERSPECTIVAS
Wittmann, “Physiology of the yeast Kluyveromyces marxianus during batch and chemostatic cultures with glucose as sole carbon source” FEMS Yeast Res., vol. Production of extracellular inulinase in high cell density batch cultures of Kluyveromyces marxianus” Appl. Van Dijken, "Production, distribution and kinetic properties of inulinase in continuous cultures of Kluyveromyces marxianus CBS 6556." Appl.
Mazutti et al., “Mathematical modeling of growth of Kluyveromyces marxianus in solid state fermentation using a packed bed bioreactor” J. Gombert, “Growth of the yeast Kluyveromyces marxianus CBS 6556 on different combinations of sugar as sole carbon and energy source” Appl. Chi, “Production of inulinase by the yeast Kluyveromyces marxianus with a disrupted MIG1 gene and an overexpressed inulinase gene,” Process Biochem., vol.
Puri, "Optimization of medium and process parameters for inulinase production from a newly isolated Kluyveromyces marxianus YS-1".
ANEXOS
MUESTRA Temperatura, °C µ, h-1 Glucosa de alimentación, g/l Recuento de cámara, Mcel/ml CASY, Mcuentas/ml DO, absorción Biomasa, g/l Permitividad, pF/cm O2, % CO2, % dO2, % Etanol , % Actividad fructanasa, U/g Actividad fructanasa, U/ml. Este programa asume que se trata de repeticiones del mismo punto a=input('¿Cuántas ejecuciones se realizaron?.