8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8.2. Cultivos en estado continuo en biorreactor
8.2.1. Primer cultivo en continuo
El diseño de experimentos que se corrió para el primer sistema en continuo generó una gran cantidad de datos provenientes tanto de los sensores de monitoreo en línea, como los fuera de línea. La tabla 8.11 muestra los parámetros asociados a cada condición, así como los resultados obtenidos de biomasa y actividad para cada caso (en el anexo B se encuentra el resto de la información generada en este experimento). Las condiciones se propusieron con base en
74 experimentos anteriores realizados por el Dr. Alejandro Arana y el equipo francés del proyecto SPECTRE (el Dr. Charles Ghommidh y la Dra. Laurence Preziosi-Belloy) que no han sido publicados.
Tabla 8.11. Resultados de biomasa y actividad enzimática del primer cultivo en estado continuo.
Muestra Temp (°C)
µ (h-1)
C_S0
(g/L)
Biomasa (g/L)
Actividad (U/ml)
Actividad (U/g)
T1R1 26 0.05 20 8.64 177.87 20,589
T2R1 34 0.05 20 7.11 812.22 114,303
T3R1 34 0.4 20 3.31 15.34 4,631
T4R1 26 0.4 20 2.92 2.92 1,113
T5R1 26 0.05 60 9.35 128.92 13,785
T7R1 34 0.05 60 6.14 74.86 12,185
T6R1 26 0.4 60 2.35 13.21 5,621
T8R1 34 0.4 60 5.73 0.55 95
T9R1 30 0.225 40 5.13 23.24 4,532
T10R1 30 0.225 40 6.55 16.54 1,814
T11R1 30 0.225 40 6.79 27.04 3,997
T12R1 30 0.225 40 5.42 23.31 4,735
T1R2 26 0.05 20 8.83 182.53 20,676
T2R2 34 0.05 20 6.94 892.24 128,628
T3R2 34 0.4 20 3.25 37.00 11,374
T4R2 26 0.4 20 3.12 3.25 936
T5R2 26 0.05 60 9.44 129.09 13,672
T7R2 34 0.05 60 5.93 71.95 12,135
T6R2 26 0.4 60 2.16 4.42 2,044
T8R2 34 0.4 60 5.87 0.47 80
T9R2 30 0.225 40 5.21 27.12 5,121
T10R2 30 0.225 40 6.78 17.52 1,943
T11R2 30 0.225 40 6.66 32.12 4,823
T12R2 30 0.225 40 5.25 23.29 4,605
T1R3 26 0.05 20 8.94 129.60 14,500
T2R3 34 0.05 20 7.05 562.07 79,748
T3R3 34 0.4 20 3.36 35.75 10,653
75
T4R3 26 0.4 20 3.05 1.87 614
T5R3 26 0.05 60 9.17 108.44 11,823
T7R3 34 0.05 60 6.37 100.91 15,837
T6R3 26 0.4 60 2.61 6.41 2,455
T8R3 34 0.4 60 6.40 1.66 259
T9R3 30 0.225 40 5.43 30.93 5,697
T10R3 30 0.225 40 6.87 19.93 2,149
T11R3 30 0.225 40 6.87 34.53 5,025
T12R3 30 0.225 40 5.36 25.96 4,842
Como se puede apreciar en las columnas de actividad de la tabla 8.11, que en la gran mayoría de las condiciones se logra una actividad enzimática más elevada que la conseguida con la misma fuente de carbono en cultivo en lote (en negritas las actividades más altas); incluso, en varias de las condiciones se detectó una mayor actividad β-fructofuranosidasa que la conseguida en los cultivos en lote con inulina y FA; probando que los cultivos en estado continuo son una mejor opción que los cultivos en lote para una alta producción de β-fructofuranosidasas a partir de Kluyveromyces marxianus SLP1.
Se han publicado diversos reportes en la literatura científica que exploran el impacto de la tasa de crecimiento de K. marxianus sobre la actividad fructanasa en quimiostato, encontrando que a velocidades específicas de crecimiento menores mejora la actividad, lo que se encuentra en concordancia con lo expuesto anteriormente. Uno de estos trabajos alcanza actividades de hasta 52 U/mg de biomasa seca a µ = 0.1 h-1 empleando inulina como fuente de carbono, mientras que con glucosa alcanzan 3.9 U/ml [92]; por lo que la tasa de dilución tiene un efecto significativo en la actividad enzimática. En otro reporte encontraron que a µ = 0.05 h-1 alcanzaban la máxima actividad, sin embargo, disminuía al incrementarse µ; los autores no probaron una tasa de crecimiento menor. La fuente de carbono utilizada fue sacarosa [64]. En el presente trabajo se detectaron actividades enzimáticas mayores a cualquier reporte y empleando glucosa como fuente de carbono; por otra parte, la cepa de K. marxianus SLP1 mostró ser una muy buena productora de la enzima de interés.
A continuación, se detalla cómo se relacionan los factores probados con la actividad de β- fructofuranosidasas.
76 8.2.1.1. Análisis por superficie de respuesta
Con los datos generados se realizó un análisis por superficie de respuesta, o para ser precisos volumen de respuesta, que muestra el impacto de cada uno de los factores probados sobre la variable de respuesta, que fue la actividad enzimática en U/ml. Para el análisis estadístico se recurrió al programa Statgraphics Centurion versión 16.2.04. La tabla 8.12 muestra el análisis de varianza para la actividad enzimática donde se verifica que tanto los factores como sus interacciones tiene un efecto estadísticamente significativo sobre la variable de respuesta, con un nivel de confianza del 95% (P < 0.05).
Tabla 8.12. Análisis de varianza para la actividad enzimática
Factor Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón F Valor P
A: Temp 122764. 1 122764. 19.99 0.0001
B: µ 439522. 1 439522. 71.56 0.0000
C: C_So 203830. 1 203830. 33.19 0.0000
AB 106548. 1 106548. 17.35 0.0003
AC 166112. 1 166112. 27.05 0.0000
BC 179047. 1 179047. 29.15 0.0000
BC 179047. 1 179047. 16.18 0.0004
Total error 153549. 25 6141.97
Total (corr.) 1.50545E6 32
Según la figura 8.12, la actividad enzimática es más alta cuando la temperatura se sitúa en 34
°C en lugar que a 26; así como una velocidad específica de crecimiento de 0.05 h-1 y una concentración de 20 g/l de glucosa en la alimentación, en lugar de valores mayores. Así mismo, la longitud de las barras en cada factor es un indicativo de la magnitud en que éste afecta la variable de respuesta. De esta manera, el factor que más impacta sobre la actividad enzimática es la velocidad específica de crecimiento.
77 Figura 8.12. Gráfico de efectos principales.
Figura 8.13. Gráfica de interacciones entre factores.
Tal como lo demuestra el análisis de varianza, la interacción entre los factores tiene un efecto significativo sobre la variable de respuesta. En la figura 8.13 se puede apreciar que la actividad enzimática es favorecida cuando los factores se encuentran en la siguiente combinación: Temp (+) – µ (-), Temp (+) – C_So (-) y µ (-) – C_So (-); es decir, mantener una temperatura que tienda hacia los 34 °C al mismo tiempo que se mantiene una velocidad de crecimiento y una concentración de sustrato bajas en ambos casos, concordando con la figura 8.12. Además, las
78 longitudes de las barras indican que la interacción µ – C_So es la que afecta en mayor magnitud la variable de respuesta.
La superficie de respuesta generada (figura 8.14) con los datos de este experimento indica el comportamiento que presenta la actividad de fructanasas en función de los factores propuestos.
Como ya se ha indicado, los valores de la actividad β-fructofuranosidasa tendieron a incrementarse conforme se elevaba la temperatura, se reducía la velocidad específica de crecimiento, así como la concentración de sustrato en la alimentación; concretamente, la máxima actividad enzimática alcanzada (755 ± 170 U/ml) se dio a una temperatura de 34 °C, velocidad específica de crecimiento de 0.05 h-1 y 20 g/l de glucosa en la alimentación. Lo que representa una frontera de las condiciones analizadas, por lo que el punto óptimo podría encontrarse fuera de la zona del análisis.
Figura 8.14. Superficie de respuesta para la actividad enzimática en función de los factores probados.
La reducción de la velocidad específica de crecimiento se consiguió disminuyendo la velocidad de alimentación, que combinado con una menor concentración de glucosa en el alimento da como resultado un descenso significativo en la disponibilidad de fuente de carbono durante el cultivo. De esta manera, se consigue recrear las condiciones de disponibilidad de glucosa que se presentan durante los cultivos con inulina y FA, con el consiguiente importante incremento de la actividad fructanasa.
µ, 1/h Temp, °C
C_So, g/l
Act. Enz., U/ml 0.0
100.0 200.0 300.0 400.0 500.0 600.0 700.0 800.0 900.0 Contours of Estimated Response Surface
C_So=60.0
26 28 30 32 34 0 0.1 0.2 0.3 0.4
20 30 40 50 60
79 Los resultados de este experimento apoyan la hipótesis que se presentó en la sección 8.1, que la actividad de β-fructofuranosidasas está directamente relacionada con la limitación continua de glucosa durante el cultivo de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1.
No se encontró ningún tipo de correlación entre el resto de parámetros monitoreados, mostrados en el anexo A, con la actividad enzimática.
Finalmente, se realizó una regresión lineal multivariada para generar un modelo que relaciona los factores probados y sus interacciones con la variable de respuesta:
𝐴𝑐𝑡. 𝐸𝑛𝑧 (𝑈 𝑚𝑙⁄ ) = −3175 + 129 𝑇𝑒𝑚𝑝 (°𝐶) + 7502 𝜇 (ℎ−1) + 57 𝐶𝑆0(𝑔
⁄ ) − 309 𝑇𝑒𝑚𝑝 ∗ 𝜇 − 2 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑙
∗ 𝐶𝑆0− 135 𝜇 ∗ 𝐶𝑆0+ 5 𝑇𝑒𝑚𝑝 ∗ 𝜇 ∗ 𝐶𝑆0
El valor R2ajustado del modelo es de 87, por lo que es capaz de explicar el 87% de la variabilidad de los datos, a un nivel de significancia del 5%.
8.2.2 Segundo cultivo en estado continuo
Con el objetivo de verificar y ampliar la zona de exploración en torno a las condiciones de mayor producción enzimática del cultivo en continuo anterior, se propuso inicialmente un diseño de experimentos 22 con puntos al centro, con temperatura de cultivo y velocidad especifica de crecimiento como factores. Los niveles propuestos fueron 30 y 38 °C para la temperatura, y 0.01 y 0.09 h-1 para la velocidad específica de crecimiento, con 34 °C y 0.05 h-1 como punto central.
El experimento se concentró en la verificación de las condiciones de mayor producción de β- fructofuranosidasas arrojadas por el primer cultivo en continuo, y el impacto de la temperatura sobre la variable de respuesta a µ = 0.05 h-1. Las condiciones que si fueron probadas son las que se muestran en la tabla 8.13, junto con los resultados de biomasa y actividad para cada caso.
Debido al bajo número de condiciones, no fue posible realizar un análisis estadístico similar al primer cultivo en continuo.
Como se puede observar en la tabla, la condición que favoreció la mayor producción de β- fructofuranosidasas fue 34 °C y µ = 0.05 h-1; justamente la misma condición que en el primer diseño experimental. Resulta llamativo que la máxima actividad alcanzada en el segundo
80 experimento es la mitad de la que se obtuvo en el primero. La única deferencia observada durante los 2 cultivos fue el porcentaje de saturación de oxígeno en el medio durante la condición de máxima actividad: en el primer cultivo se mantuvo entre 2.5 y 3.5%, mientras que en el segundo cultivo se mantuvo por debajo del 1%; es importante señalar que debido al margen de error del propio sensor de oxígeno, la saturación durante el segundo cultivo pudo haber caído a 0%. Aunque en el segundo experimento la aireación fue del doble que en el primero, los volúmenes de trabajo fueron diferentes (1.5 L para el primero y 2.2 L para el segundo); lo que resulta en una diferencia en el flujo neto de aire aún mayor (1.5 L/min para el primer caso y 4.4 L/min para el segundo). La velocidad de aireación puede incrementar el tamaño de burbuja, que a su vez impacta de manera negativa el coeficiente de transferencia de oxígeno al medio de cultivo [100]–[102]; para contrarrestar esa consecuencia, se incrementó la agitación de 500 a 550 rpm en el segundo diseño. La estrategia empleada no fue suficiente para mejorar el porcentaje de saturación de oxígeno disuelto. Por otro lado, no era recomendable incrementar la agitación por encima de los 550 rpm; pues como lo reporta Silva-Santisteban y Maugeri [65], la producción de inulinasa comienza a decrecer a partir de una agitación superior a 500 rpm. Estos resultados sugieren que la producción de β-fructofuranosidasas se encuentra afectada de manera importante por la disponibilidad de oxígeno disuelto en el medio.
Tabla 8.13. Condiciones y resultados para el segundo cultivo en continuo.
Muestra Temperatura,
°C
Velocidad específica de crecimiento, h-1
Biomasa g/l
Actividad U/ml
Actividad kU/g *
T1 34 0.05 6.4 398 ± 30 63 ± 5
T2 30 0.05 7.5 126 ± 9 16.9 ± 1.3
T3 38 0.05 7.7 295 ± 30 38.1 ± 4
T4 34 0.09 6.4 65 ± 6 10.2 ± 1.1
* kU/g = 1000 U/g o U/mg
La figura 8.15 muestra cómo se afectó la actividad enzimática por la temperatura a una velocidad específica de crecimiento de 0.05 h-1. Se aprecia una caída de la actividad más pronunciada a temperaturas menores de 34 °C que a temperaturas mayores; produciendo hasta 69% menos a 30 °C y 26% menos a 38 °C que a 34 °C. Dentro del equipo de trabajo de biotecnología industrial de CIATEJ, Núñez-López reportó que la mejor temperatura para la producción de fructanasas
81 fue de 20 °C en cultivo realizados a nivel matraz, con actividades de hasta 7.93 ± 0.6 U/ml [25];
lo que es evidencia del impacto que puede tener el sistema de cultivo en la producción de metabolitos de interés.
Figura 8.15. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática a µ = 0.05 h-1.
Finalmente, la actividad enzimática medida sobre la muestra 4 obtenida bajo las condiciones de 34 °C y µ = 0.09 h-1 prueba el fuerte efecto que tiene la disponibilidad de glucosa sobre la actividad de la enzima de interés. Con solo subir la tasa de dilución de 0.05 a 0.09 h-1 a 34 °C, la actividad enzimática cayó un 84%.
El segundo cultivo en continuo se realizó también con el objetivo de validar la metodología para el monitoreo en línea de la actividad enzimática mediante un sistema de análisis de inyección secuencial, cuyos resultados se presentan y discuten en la sección 8.5.3.
Una vez que se verificó que a 34 °C se favorecía la producción de β-fructofuranosidasas en cultivos en continuo, se decidió evaluar el comportamiento de la levadura y la producción de la enzima a dicha temperatura en un cultivo en lote. Además, se mantuvieron los cultivos durante un tiempo prolongado aun cuando se había agotado la fuente de carbono.
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