UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
TESIS
PRESENTADO POR LA BACHILLER :
JIMENEZ YGNACIO YENY LOURDES
PARA OPTAR EL TITULO PROFECIONAL DE
INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
HUANCAYO - PERÚ
2014
“EVALUACION DE LA ESTABILIDAD DEL COLORANTE DE AIRAMPO (Opuntia soehrensii
Britton & Rose)”
ASESOR:
M. Sc. EMILIO FREDDY YABAR VILLANUEVA
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
“EVALUACION DE LA ESTABILIDAD DEL COLORANTE DE AYRAMPO” (
Opuntia soehrensii Britton & Rose)TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
JURADOS EXAMINADORES DE LA TESIS
PRESIDENTA
Dra. Nora Marina Veliz Sedano
JURADO JURADO
M.Sc. Edgar R. Acosta López M.Sc. Elizabeth Paitan Anticona
JURADO SECRETARIO
Dra. Clara R. Espinoza Silva Ing. Wagner Vásquez Orihuela
A Dios por ser la luz en mi camino para el logro de mis objetivos por
su infinita bondad y amor.
A mis padres por el esfuerzo y apoyo incondicional que me han brindado a lo largo
de mi vida, por su amor y consejos que hicieron posible la culminación de mi
formación profesional.
AGRADECIMIENTO
Primeramente a Dios por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado salud, ser el manantial de vida y darme lo necesario para seguir adelante día a día para lograr mis objetivos , además de su infinita bondad y amor.
Al M.Sc. Freddy Emilio Yabar Villanueva, por su asesoría y por haber guiado el desarrollo de este trabajo de investigación y llegar a la culminación del mismo.
A mi amado Esposito Axel por su apoyo incondicional, su motivación constante, su paciencia y comprensión pero más que nada por el gran amor que me demuestra día a día, siendo mi amigo y compañero inseparable.
A mi precioso bebe Rodrigo kalel para quien ningún sacrificio es suficiente, y que con su luz ha iluminado mi vida y hace mi camino más claro.
A mi padre por los ejemplos de perseverancia y constancia que lo caracterizan y que me ha infundado siempre, por el valor mostrado para salir adelante y por su amor.
A mi madre por haberme apoyado en todo momento, por sus consejos, sus valores, por la motivación constante que me ha permitido ser una persona de bien, pero más que nada, por su amor.
A mis hermanos por ser parte importante de mi vida y representar la unidad familiar. A Miguel y Maribel por ser un ejemplo de desarrollo profesional a seguir, a Percy y Roxana por llenar mi vida de alegrías y amor cuando más lo he necesitado.
A mis maestros, gracias por su tiempo, por su apoyo así como por la sabiduría y conocimientos que me transmitieron en el desarrollo de mi formación profesional.
A todas las personas que de una y otra forma contribuyeron a la realización del presente
trabajo de investigación.v
ÍNDICE GENERAL
CONTENIDO PAGINA
RESUMEN
I. INTRODUCCIÓN 1
II. REVISION BIBLIOGRAFICA 3
2.1 Ayrampo 3
2.1.1. Origen y usos 3 2.1.2. Características botánicas 3
2.1.3. Características taxonómicas 4
2.1.4. Composición químico proximal 5 2.1.5. Alternativas de industrialización del ayrampo 6 2.1.6. Contenido de betalainas en el ayrampo 7
2.2. Definición de colorante 7
2.2.1. Clasificación de los colorantes 8
2.2.1.1. Colorantes artificiales 9
2.2.1.2. Colorantes naturales 10
2.3. Importancia del color en la industria alimentaria 11 2.4. Fuentes de colorantes naturales y aplicaciones 12
2.5. Regulación de colorantes 12
2.6. Betalainas 15
2.6.1. Estructura química 16
2.6.2. Propiedades físicas 17
2.6.3. Propiedades químicas 17
2.6.4. Clasificación de las betalainas 18
a. Betacianinas 18
b. Betaxantinas 19
2.6.5. Biosíntesis de las betalainas 20
2.6.6. Factores que gobiernan la estabilidad de las betalainas 21
a. Calor y/o acidez 22
b. Efecto del oxígeno y luz 24
c. Efecto del pH 24
d. Efecto de los cationes metálicos 26
e. Efecto de antioxidantes 26
f. Efecto de secuestrantes 27
g. Efecto de la actividad de agua 27
2.6.7. Identificación de betalainas 28
2.6.8. Extracción, purificación y cuantificación de betalainas 28
III. MATERIALES Y METODOS 30
3.1. Lugar de ejecución 30
3.2. Materia prima 30
3.3. Equipo y materiales 30
3.3.1. Equipos 30
3.3.2. Materiales de vidrio 30
3.3.3. Reactivos 31
3.4. Métodos de evaluación utilizados en la materia prima 31 3.4.1. Caracterización física del ayrampo 31 3.4.2. Análisis químico proximal del ayrampo 31
a. Determinación de humedad 31
b. Determinación de proteína 32
c. Determinación de cenizas 32
d. Determinación de grasa cruda 32
e. Determinación de carbohidratos 32
3.4.3. Características fisicoquímicas de la pulpa de ayrampo 32
a. Determinación de pH y acidez 32
b. Determinación de sólidos solubles 33
c. Determinación de la densidad 33
d. Determinación del índice de madurez 33
3.5. Metodología y procedimiento de trabajo 33
3.5.1. Obtención del colorante de ayrampo 33
a. Recepción de materia prima 33
b. Lavado de la materia prima 34
c. Escaldado 34
d. Pelado 34
e. Extracción por presión 34
f. Filtración 34
g. Purificación del colorante 34
h. Centrifugación 35
g. Separación del solvente 35
j. Concentración al vacío 35
3.6. Métodos de evaluación utilizados en el colorante 37 3.6.1. Características fisicoquímicas del colorante 37
a. Determinación de pH y acidez 37
b. Determinación de sólidos solubles 37
c. Determinación de la densidad 37
3.6.2. Identificación de los pigmentos presentes en el colorante 37 3.6.3. Cuantificación de los pigmentos presentes en el colorante 38 3.6.4. Evaluación de la estabilidad del colorante 39
3.7. Diseño estadístico experimental 40
3.8. Análisis estadístico 42
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES 43
4.1. Resultados de la evaluación a la materia prima 43 4.1.1. Características físicas del ayrampo 43 4.1.2. Análisis químico proximal del ayrampo 44 4.1.3. Características fisicoquímicas de la pulpa de ayrampo 45
a. Determinación de pH y acidez 45
b. Determinación de solidos solubles 45
c. Determinación de la densidad 45
4.2. Obtención del colorante 46
4.3. Métodos de evaluación utilizados en el colorante de ayrampo 49 4.3.1. Características fisicoquímicas del colorante 49
a. Determinación de pH y acidez 49
b. Determinación de sólidos solubles 49
c. Determinación de la densidad 49 4.3.2. Identificación de los pigmentos presentes en el colorante 49 4.3.3 Cuantificación de los pigmentos presentes en el colorante 51 4.4. Evaluación de la estabilidad del colorante 52 4.4.1. Efecto del pH y temperatura en el colorante 52
a. Efecto del pH 52
b. Efecto de la temperatura 58
V. CONCLUSIONES 63
VI. RECOMENDACIONES 65
VII. BIBLIOGRAFIA 66
VIII. ANEXOS 71
INDICE DE CUADROS
CUADRO TITULO PÁGINA
01 Características taxonómicas del ayrampo 5
02 Composición químico proximal 6
03 Lista de colorantes usados en la industria de alimentos 14 04 Códigos de las muestras para evaluar la estabilidad 40
05 Caracterización física del ayrampo 43
06 Resultados del análisis químico proximal del ayrampo 44 07 Características fisicoquímicas de la pulpa de ayrampo 46 08 Proceso de concentración de los sólidos solubles 47 09 Volumen de agua evaporada en el proceso de concentración 48 10 Características fisicoquímicas del colorante 49 11 Cantidad inicial de betalainas después de la variación de pH y T° 51 12 Porcentaje de betacianinas retenidas 52 13 Porcentaje de betaxantinas retenidas 53 14 Porcentaje de pigmento retenido al final del tratamiento 54
INDICE DE FIGURAS
FIGURA TITULO PÁGINA
01 Planta de ayrampo 4
02 Ayrampo proveniente del Colca – Arequipa 5
03 Formula general de las betalainas 16
04 Estructura química de la betanina 19
05 Estructura química de la isobetanina 19
06 Estructura de las betaxantinas 20
07 Biosíntesis de las betalainas 21
08 Factores que gobiernan la estabilidad de las betalainas 22
09 Degradación reversible de la betanina 23
10 Degradación de betanina en medio ácido y/o por calor 24
11 Espectro de la betanina a pH 2,5 y 9. 25
12 Diagrama para la obtención del colorante de ayrampo 36 13 Diseño experimental para la evaluación de la estabilidad 41 14 Proceso de concentración de los sólidos solubles 47 15 Agua evaporada en el proceso de concentración del colorante 48 16 Espectros de absorción del colorante de airampo 50 17 Efecto del pH sobre la estabilidad de las betacianinas 4oC 55 18 Efecto del pH sobre la estabilidad de las betaxantinas 4oC 56 19 Efecto del pH sobre la estabilidad de las betacianinas 19oC 56 20 Efecto del pH sobre la estabilidad de las betaxantinas 19oC 57 21 Efecto del pH sobre la estabilidad de las betacianinas 63oC 57 22 Efecto del pH sobre la estabilidad de las betaxantinas 63oC 58 23 Efecto de la To sobre la estabilidad de las betacianinas pH4 60 24 Efecto de la To sobre la estabilidad de las betaxantinas pH4 60 25 Efecto de la To sobre la estabilidad de las betacianinas pH5 61 26 Efecto de la To sobre la estabilidad de las betaxantinas pH5 61 27 Efecto de la To sobre la estabilidad de las betacianinas pH6 62 28 Efecto de la To sobre la estabilidad de las betaxantinas pH6 62
RESUMEN
A partir de los frutos de ayrampo (Opuntia soehrensii Britton & Rose), se obtuvo el extracto de la pulpa con sólidos solubles expresados como °Brix de 11como valor inicial, este extracto fue purificado con etanol de 96% (para la desnaturalización de la pectina) la relación que se uso fue de 1:1 (extracto/ etanol), el extracto etanólico obtenido fue centrifugado para separar todas aquellas las partículas que le daban turbidez al extracto, posteriormente se recuperó el solvente en el rotavapor a 40 rpm, 50 °C de temperatura en un tiempo de 20 minutos, finalmente se concentró el extracto en el rotavapor a 50 rpm, 50 °C de temperatura en un tiempo de 90 minutos , hasta alcanzar un valor de 40 °Brix ± 0,20, a este colorante se le realizaron distintos análisis al inicio y al final de su proceso de concentración como pH, °Brix, acidez, densidad. En el presente trabajo de investigación se evaluó la estabilidad del colorante obtenido a partir de la pulpa de ayrampo, cactácea que produce frutos de pulpa roja, la evaluación de la estabilidad se realizó a tres valores diferentes de pH y temperatura durante cuatro semanas haciendo el monitoreo cada semana. Para lo cual se colocó 3mL del colorante en tubos de ensayo herméticos a tres diferentes valores de pH (4, 5 y 6), estas muestras fueron expuestas a temperaturas de 4 °C, 19 °C, 63 °C,estas pruebas se realizaron por triplicado, para la regulación de pH se utilizó hidróxido de sodio 1N. La variable de respuesta que se uso fue el porcentaje de pigmento retenido de betalainas, en el colorante, en el transcurso de las cuatro semanas, mediante la medición de la absorbancia la cual se realizaba cada semana a (538 nm para betacianinas y 480 nm para las betaxantinas). Se efectuó un análisis de varianza (ANVA) y un análisis factorial 3*3, por triplicado, donde se determinó que factores degradaron el pigmento para un nivel de significancia de 0.95, con la prueba de Tukey, para los valores obtenidos en cada uno de las condiciones sometidas, Concluyendo que el extracto fue más estable en las condiciones de 4 °C y un pH de 5, debido a que a estas condiciones se retuvo mayor porcentaje de pigmento 79,39% de betacianinas y un 63,47% de betaxantinas, comparadas con las otras muestras.
I. INTRODUCCION
Los colorantes artificiales han sido muy demandados por la industria alimentaria, pero en los últimos años su uso se ha ido restringiendo por los conocidos efectos nocivos que imparten a la salud. Actualmente existe un considerable interés mundial en la busqueda de nuevas fuentes de colorantes naturales. Numerosos estudios enmarcan a los colorantes como productos funcionales, así tenemos el caso de las antocianinas, carotenoides, entre otras, debido a que su uso tiende no solo a otorgar una calidad sensorial (color), sino también ofrecería otras potencialidades en el área nutricional y médica. En la búsqueda de nuevas fuentes para la extracción de colorantes naturales se encontró al ayrampo
El ayrampo (Opuntia soehrensii Britton & Rose), es una especie originaria de los Andes peruanos, encontrándose en estado silvestre en los departamentos de Arequipa, Ayacucho, Apurímac y Junín.
Es utilizada de forma artesanal para dar color a postres y refrescos, teñido de fibras de lana, así como en la medicina casera para aliviar ciertos males. Sin embargo, es poca la importancia que se le ha dado debida a la escasa y dispersa información que existe sobre ella. Este fruto puede ser considerado una fuente de color interesante, además de las propiedades funcionales hecho que podría iniciar la producción de esta línea favoreciendo el nivel de vida y el desarrollo rural de los pobladores andinos.
Las betalainas son los pigmentos presentes en el ayrampo; son hidrosolubles y comprenden a las betacianinas de color rojo violáceo y las betaxantinas de color amarillo. La presencia de estos pigmentos en las plantas tiene gran importancia, debido a que su distribución está limitada a 10 familias del orden Centrosperma.
Las betalainas se encuentran en la beterraga, amaranto, diversos frutos del cactus, así como en flores como la buganvilia. Las aplicaciones de estos colorantes están destinados a productos que reciben un limitado tratamiento térmico, baja actividad de agua, corto tiempo de vida en anaquel. La ventaja de
este colorante es que su color se mantiene estable en el rango de pH 4 a 7, valor en el que están incluidos la mayoría de alimentos.
La importancia de la evaluación de la estabilidad de los colorantes naturales, como las betalainas se ha incrementado en los últimos años, debido a que el uso de algunos colorantes artificiales se ha limitado y la seguridad de algunos se viene cuestionando.
La estabilidad de las betalainas presente en los colorantes naturales depende de muchos factores como pH, temperatura, actividad de agua, concentración de oxígeno, etc.
El presente trabajo de investigación tiene como objetivos:
Obtener y caracterizar el colorante de ayrampo.
Evaluar la estabilidad del colorante de ayrampo frente a tres valores diferentes de pH y temperatura.
II. REVISION BIBLIOGRAFICA 2.1. Ayrampo
2.1.1. Origen y usos
El ayrampo, ayrampu o hairampu es el nombre común de Opuntia soehrensii Britton & Rose, que pertenece a la familia de las Cactaceae, no es un fruto muy conocido, sin embargo tiene orígenes incaicos. (Medina y Romero, 2000).
Esta tiene flores grandes, olorosas y sus frutos son comestibles, utilizados de diversas maneras, como para dar color a postres, refrescos, y también para el teñido artesanal de fibras de lana (Lock, 1997).
2.1.2. Características botánicas
Lock (1997), El ayrampo es una planta herbácea, pequeña, de tallos o pencas ovoidales aplastadas, con espinas sedosas y aciculares, la flor es semejante a las de otras cajteas, nopaleas y opuntiáceas de un color rojo sangre, sus frutos son pequeñas bayas carnosas con semillas globulosas rojas, que cuando están en el periodo de maduración son de color rojizo o vinoso, muy jugosas, de sabor ligeramente dulce.
Es una planta silvestre que crece a más de 3 000 metros sobre el nivel del mar, originaria de los andes peruanos (Arequipa, Ayacucho, Apurímac, Junín), de donde es originaria, alcanzando su mejor desarrollo entre 1700 y 2500 msnm ; crece en suelos sueltos, arenosos, calcáreos en tierras marginales y poco fértiles, superficiales, pedregosos, caracterizándole una amplia tolerancia edáfica; sin embargo, los suelos altamente arcillosos y húmedos no son convenientes para su cultivo (Sarmiento, 2003).
Su reproducción se efectúa por medio de semillas o por propagación agámica o también denominada “propagación por pencas”, este
último es el más común y consiste en plantar o enterrar pencas (Medina y Romero, 2000).
Respecto a las semillas o pepas secas de ayrampo (Cruz, 1985), menciona que el contenido de pepas en los frutos secos de ayrampo representa el 27,2% del peso total de muestra (pepa + pulpa).
Además, citó que estas semillas se encuentran recubiertas por un tejido parenquimatoso que contiene el colorante, que representa el 3,5% de la muestra (pepa + pulpa).
Figura 1. Planta de Ayrampo (Opuntia soehrensii Britton & Rose).
2.1.3. Características taxonómicas
Sarmiento (2003), cita que la ubicación sistemática del ayrampo es la siguiente:
Cuadro 1. Características taxonómicas.
Reino: Vegetal.
División: Antofitas.
Clase: Dicotiledóneas.
Orden: Centrosperma.
Familia: Cactaceas.
Tribu: Nopaleras.
Género: Opuntia.
Especie: Opuntia soherensii.
Figura 2. Frutos de ayrampo proveniente de la provincia del colca, Arequipa – Perú.
2.1.4. Composición químico proximal
En el cuadro 2, se muestra la Tabla de Composición Químico Proximal del ayrampo, dada por el Centro Nacional de Alimentos y Nutrición (2009).
Cuadro 2. Tabla de composición químico proximal del ayrampo (Composición por 100g de ayrampo).
Fuente: Centro Nacional de Alimentos y Nutrición (2009).
2.1.5. Alternativas de industrialización del ayrampo
A pesar de los múltiples usos que reporta este recurso natural su difusión a nivel de la industria alimentaria y textil es restringida.
Sobre su comercialización no se registran datos en los anuarios de los Ministerios de Agricultura y Comercio Exterior, dado a que es una planta silvestre.
En el departamento de Arequipa se comercializa las semillas secas relativamente a pequeña escala, por expendio o por venta directa de los pequeños productores (campesinos de los lugares donde crece el ayrampo) a las tiendas de abarrotes y a los pequeños comerciantes que venden especerías. (Medina y Romero, 2000).
Estos reportes son válidos hasta la actualidad; debido a que no se
Componente Cantidad (g)
Energía (kcal) 49.0 kcal
Agua (g) 85.9
Proteína (g) 1.8
Grasa (g) 0.5
Carbohidrato (g) 11.6
Ceniza (g) 0.6
Calcio (g) 85.0
Fosforo (g) 0.2
Rivoflavina (g) 0.01
Tiamina(g) 0.02
Niacina (g) 24.0
ha encontrado aún empresas dedicadas a la industrialización del ayrampo.
La industrialización del ayrampo, como colorante natural es muy interesante; debido a que la gama de productos terminados cuyo color característico está en el rango de tonalidad rojo es amplia, además la tendencia actual de consumir alimentos naturales que tengan beneficios potenciales para la salud, posibles propiedades que se le atribuye al pigmento de este vegetal (Sarmiento, 2003) . 2.1.6. Contenido de betalaínas en el ayrampo
La materia colorante, al igual que en la beterraga (Beta vulgaris), es la betacianina. Las semillas de ayrampo contienen alrededor de 1%
del pigmento (Lock, 1997), estas semillas se encuentran recubiertas por un tejido parenquimatoso que contiene el colorante.(Cruz, 1985).
2.2. Definición de colorante
La vista permite juzgar el aspecto de un alimento en términos de su forma, textura y color. El aspecto de un alimento es la primera clave de su identificación y con frecuencia predice el grado de satisfacción o placer que se obtendrá al comerlo. Probablemente el color es el más importante de los factores visuales responsables de la aceptación o rechazo de los alimentos.
La intensidad del color con frecuencia significa intensidad del sabor. Las variaciones en la intensidad del color pueden sugestionar al consumidor dándole la idea de que el alimento estuvo sujeto a un proceso mal controlado. En los alimentos la variedad de color es atractivo e implica diversidad de sabores y texturas. (Badui, 2006).
Un colorante es cualquier sustancia química natural o sintética que confiere color. Los alimentos tienen color debido a su capacidad para reflejar o emitir diferentes cantidades de energía a longitudes de onda que estimulen la retina del ojo. El intervalo de energía al cual es sensible el ojo se conoce
como luz visible, dependiendo de la sensibilidad individual, abarca longitudes de onda aproximadamente de 380 – 770 nm. (Fennema, 2000).
La homogeneidad del color de los productos durante todo el año es fundamental, el público desea encontrar siempre el alimento con los mismos colores, por estas razones existen en el mercado diversos agentes químicos que sirven para colorear, denominados colorantes, los cuales básicamente los hay de dos tipos los naturales y los sintéticos. (Coultate, 1984).
El término colorante se utiliza comúnmente en la industria textil. En la industria alimentaria de los EEUU, se entiende por colorante aquel que posee una pureza de grado alimentario, es soluble en agua y está certificado por la U.S. Food and Drug Administration (FDA). (Fennema, 2000).
2.2.1. Clasificación de los Colorantes
Los colorantes se pueden clasificar de acuerdo a varios criterios;
según su origen:
Orgánicos o naturales: procedentes de plantas y animales, tales como la clorofila, carotenos, betalainas, flavonoides y antocianinas entre otros.
Minerales: tales como las lacas, sulfato de cobre y cromato de potasio entre otros; no se usan en alimentos porque llevan iones metálicos.
Artificiales: Obtenidos por síntesis química (Cenzano, 1996).
De acuerdo a su solubilidad son hidrosolubles ó liposolubles.
La FDA creo tres categorías para clasificar a los colorantes (Marmión, 1991).
1. Colorantes FD&C: Certificados para uso en alimentos, drogas y cosméticos en general.
2. Colorantes D&C: Tintes y pigmentos considerados seguros en drogas y cosméticos ingeridos o usados en contacto directo con membranas mucosas.
3. Colorantes Ext. D&C: Colorantes que, por su toxicidad oral, no se usan en productos para ingestión, pero que son considerados seguros para uso externo.
Las regulaciones de la FDA distinguen dos tipos de aditivos colorantes (Fennema, 2000).
I. Colorantes “Certificados” (Artificiales).
II. Colorantes “No certificados” ( Naturales).
2.2.1.1. Colorantes artificiales
Son aquellos colorantes obtenidos mediante un proceso químico industrial y existen una gran cantidad de ellos; sin embargo solo algunos están aprobados para su uso en alimentos en relación con la toxicidad o inocuidad de cada uno de ellos; ejemplos de estos compuestos son la tartracina, el amarillo – anaranjado S, amarillo de quinoleína, azul patentado V, indigotina o índigo carmín, azul n° 1, rojo cítrico n° 2, rojo n° 40 y el amarillo n° 6, entre otros. (Badui, 2006).
El Rojo arrulla (E – 129 o FD&C Rojo n° 40), es uno de los colorantes sintéticos más usados en el procesamiento de alimentos. Es una sal disódica muy soluble en agua y poco en etanol, cuya forma comercial es un polvo rojo oscuro y sus aplicaciones están sugeridas en productos cárnicos, dulces, etc. (Cubero, 2002).
Lock (1997), menciona que el rojo arrulla es un colorante azoico y que puede provocar intolerancia en aquellas
personas que se vean afectadas por los salicilatos .Además, es un liberador de histamina, y pueden intensificar los síntomas del asma. Así mismo, está implicado en la producción de hiperactividad en niños, cuando es utilizado en combinación con los benzoatos. Cuando está presente en altas concentraciones, uno de sus productos de degradación causa cáncer de vejiga en los animales. La ingesta máxima diaria es 7mg/kg de peso corporal.
2.2.1.2. Colorantes naturales
Los colorantes naturales son pigmentos que se encuentran en la naturaleza y que se extraen por diferentes métodos.
(Cubero, 2002).
Son aquellos colorantes exentos de certificación por parte de la FDA, estos pigmentos naturales pueden ser generados por microorganismos, vegetales, animales y minerales, (Badui, 2006), de ellos la fuente vegetal es la principal, clasificada en cuatro grupos básicos: carotenoides (caroteno, licopeno y xantofilas), benzopirenos (antocianinas y flavonoides), betalainas (betacianinas y betaxantinas) y tetrapirroles. (Márquez y García, 2007).
De estos grupos de pigmentos, las betalainas han sido estudiadas con mucho menor intensidad, sin embargo;
desde los últimos cinco años los científicos de alimentos vienen estudiando las betalainas desde la perspectiva tecnológica y nutricional. (Stintzing y Carle, 2007).
Aunque estos compuestos están exentos de los requerimientos de certificación formal de la FDA, para asegurar que su pureza está de acuerdo con las especificaciones; requieren permiso de la FDA para ser
incluidas en la lista de colorantes no certificados. Los colorantes exentos de certificación en Estados Unidos son:
oleorresina, paprika, β – caroteno, extracto de cochinilla, jugos de frutas y vegetales, extracto de piel de uva, color caramelo y dióxido de titanio, entre otros. (Wissgott, 1996).
La mayoría de los pigmentos vegetales se localizan en el protoplasma de la célula dentro de los plástidos, en algunos casos cuando los pigmentos son hidrosolubles, se localizan disueltos en la vacuolas de las células (Badui, 2006;
Fennema,2000).
2.3. Importancia del color en la industria alimentaria
Es muy importante el color en los alimentos, debido a que permite la aceptación y prácticamente es lo primero que impacta al consumidor. Junto con la aceptabilidad esta la identificación del alimento a través del color.
Por esta razón, en el desarrollo y formulación de los alimentos, juegan un papel importante los colorantes como aditivos alimentarios (Fraser, 1998).
Por tal motivo la industria de pigmentos es una de las de mayor volumen de ventas a nivel mundial; se producen 700 toneladas / año de pigmentos naturales y sintéticos. El mercado mundial de pigmentos sintéticos representa un volumen de ventas de 400 millones de dólares / año, de los cuales el 50% se dirige a la industria textil y 25% a la industria alimentaria.
(Badui, 2006).
El color es uno de los factores sensoriales más importantes; debido a que un alimento, por muy nutritivo, aromático o bien texturizado que sea, solo se comerá cuando posee un color característico (Fennema, 2000). Los alimentos naturales tienen su propio color y lo ideal sería que se mantuvieran a lo largo del proceso de transformación en la industria; pero la mayoría de veces no es así. Sin embargo, los consumidores prefieren en determinados alimentos un color constante que no varié en los diferentes
lotes de fabricación de un producto y esto solo puede obtenerse modificándolo de forma artificial. (Cubero, 2002)
2.4. Fuentes de Colorantes naturales y aplicaciones
En años recientes se ha renovado el interés en colorantes naturales por limitaciones en el uso de algunos sintéticos debido a su toxicidad. Esto ha originado un considerable interés mundial en el desarrollo de los colorantes naturales, como fuentes naturales de estos colorantes podemos considerar las plantas superiores, las algas, hongos y líquenes, algunos insectos, así como algunos organismos marinos invertebrados. (Lock, 1997).
Se pueden obtener en forma de:
Zumo de frutas. Se usan en su forma concentrada como agentes colorantes y típicamente contienen carotenoides y antocianinas.
Extracto de gardenia. Producida por el jugo de la planta que contiene una variedad de pigmentos incluyen un carotenoide soluble y flavonoides.
Extracto de la piel de la uva. Obtenida por extracción del residuo producido del prensado de la uva durante la producción de vino.
Extractos verdes que se obtienen de la espinaca y alfalfa. (Wissgott, 1996).
Los colorantes naturales, aun con sus limitaciones, tienen gran importancia industrial y son usados en la fabricación de embutidos y productos cárnicos, gelatinas, helados, postres, productos lácteos, textiles, cosméticos y farmacéuticos entre otros (Hernández, 1996).
2.5. Regulación de colorantes
Los colorantes se añaden a los alimentos en muchos países del mundo pero, el tipo de colorante cuyo uso está permitido varía notablemente de unos países a otros. De cualquier manera, el comercio internacional es
cada día más importante, por lo que la regulación sobre colorantes actualmente es una preocupación internacional. Desgraciadamente, no existe una lista mundial de todos los aditivos colorantes permitidos; por tanto, los aditivos colorantes en algunos casos representan una barrera al comercio. Sin embargo, los principios que rigen la legislación en alimentos son similares en todo el mundo. La Unión Europea se basa en tres principios importantes: 1) protección de la salud del consumidor, 2) prevención de fraudes, 3) eliminar barreras de comercialización. Las autoridades legislativas de la antes Comunidad Económica Europea (CEE) intentaron uniformizar la legislación para aditivos colorantes de los países del Mercado Común para lo cual a cada colorante permitido se ha asignado la letra E seguido por un número (Francis, 1999).
En Estados Unidos a partir de 1938, el uso de colorantes está controlado por la FDA y se refiere a dos categorías de colorantes: colorantes certificados y colorantes exentos de certificación. Paro los colorantes certificados el proceso de certificación consiste en realizarles análisis químicos, bioquímicos, toxicológicos y médicos, los cuales deben garantizar la salud de los consumidores.
Los colorantes certificados se clasifican como listados permanentemente o provisionalmente. Un colorante certificado “provisionalmente” puede utilizarse legalmente a la espera de completar toda la investigación científica necesaria para determinar en pro o en contra de su aprobación permanente.
Los colorantes exentos de certificación o son pigmentos naturales o colorantes sintéticos específicos que son idénticos a los naturales; un ejemplo de estos últimos es el β – caroteno que se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza, pero que también ha sido sintetizado para alcanzar la condición de sustancia idéntica a la natural.
Dependiendo del país, se permite el uso de determinados colorantes. En el cuadro 3, se muestran los aditivos colorantes utilizados en la industria de alimentos con sus indicadores de si son nocivos, peligrosos y/o son de origen natural (http://www.e-aditivos.com/Colorantes).
Cuadro 3. Lista de aditivos colorantes utilizados en la industria de alimentos origen e indicadores de si son nocivos, peligrosos.
E NOMBRE ORIGEN COLORANTE
E – 100 Curcumina Vegetal No nocivo
E – 101 Riboflavina Animal No nocivo
E – 102 Tartrazina Químico Peligroso
E – 104 Amarillo de quinoleína Químico Sospechoso
E – 106 Lactoflavina Natural No nocivo
E – 110 Amarillo anaranjado S, amarillo ocaso FCF Químico Peligroso E – 120 Cochinilla, ácido cárminico, carmines Animal Peligroso
E – 122 Azorrubina, carmoisina Químico Peligroso
E – 123 Amaranto Químico Peligroso
E – 124 Rojo de cochinilla A Químico Peligroso
E – 127 Eritrosina Químico Peligroso
E – 128 Rojo 2G Químico Peligroso
E – 129 Rojo allura AC Químico Peligroso
E – 131 Azul patente V Químico Peligroso
E – 132 Indigotina, carmín de índigo Químico No nocivo
E – 133 Azul brillante FCF Químico Sospechoso
E – 140 Clorofilas y clorofilinas Vegetal No nocivo
E – 141 Compuestos cúpricos de clorofilas y clorofilinas Químico Sospechoso
E – 142 Verde S Químico Peligroso
E – 150 Caramelo Natural Sospechoso
E – 151 Negro brillante BN, negro PN Químico Peligroso
E – 153 Carbón vegetal o animal Natural Sospechoso
E – 154 Marrón FK Químico Peligroso
E – 155 Marrón HT Químico Peligroso
E – 160 Carotenoides Vegetal No nocivo
E – 161 Xantofilas Vegetal No nocivo
E – 162 Rojo de remolacha, betanina Vegetal No nocivo
E – 163 Antocianinas Vegetal No nocivo
E – 170 Carbonatos de calcio Químico No nocivo
E – 171 Dióxido de titanio Químico Sospechoso
E – 172 Óxidos e hidróxidos de hierro Químico No nocivo
E – 173 Aluminio Químico Sospechoso
E – 174 Plata Químico Sospechoso
E – 175 Oro Químico Sospechoso
E – 180 Litolrrubina BK Químico Peligroso
Fuente: (http://www.e-aditivos.com/Colorantes).
2.6. Betalaínas
El termino betalaínas describe a dos grupos de pigmentos, muy solubles en agua, relacionados química y biogenéticamente, estos son, las betacianinas de color rojo violeta (λmax = 540 nm) y las betaxantinas de color amarillo (λmax = 480 nm). Aunque la química de estos compuestos fue muy estudiada por numerosos investigadores, los resultados fueron recién satisfactorios en 1957, cuando Wyler Dreiding aisló cristales rojo violeta, betanina, de la raíz de la beterraga (Beta vulgaris), y en 1964 Piatelli y col.
aislaron cristales amarillos, indicaxantina, de los frutos de Opuntia ficus – indica. (Lock, 1997).
Las plantas que contienen estos pigmentos se limitan a diez familias del orden Centrospermae las cuales son: Chenopodiaceae, Amaranthaceae, Portulacaceae, Nyctaginaceae, Phytolacaceae, Stegnospemaceae, Arizoaceae, Bascallaceae, Mesembryanthemaceae, Cactaceae y Didieraceae. La presencia de betalainas en plantas es mutuamente
excluyente de la presencia de antocianinas. Entre las hortalizas comunes que contienen betalaínas está la beterraga (betabel). (Fennema, 2000).
Son un alrededor de 70 pigmentos hidrosolubles, que se encuentran compartamentizadas dentro de las células en las vacuolas con estructura de glucósidos derivados de la 1,7 – diazaheptametina. Pierden coloración bajo la influencia de factores como el pH, temperaturas altas, el oxígeno, la luz y la actividad acuosa. (Badui, 2006).
Figura 3. Formula general de las betalainas.
2.6.1. Estructura química
Las betalaínas son compuestos orgánicos solubles en agua, la estructura de las betalaínas es diferente a la de otros pigmentos encontrados en el reino vegetal, ya que esta contiene nitrógeno.
Además la estructura del cromóforo en las betalainas es un sistema 1,7 – diazaheptametino protonado 2, 16,21-23
. A la fecha se conocen unas sesenta betalainas y todas ellas poseen la misma estructura
básica, formada por la condensación de una amina primaria o secundaria como el triptófano y un aldehído llamado ácido betálamico (Fennema, 2000).
2.6.2. Propiedades físicas
Las betalaínas absorben fuertemente la luz. El valor de la absortividad (A1%1cm) es de 1 120 para la betacianina y 750 para la betaxantina, lo cual sugiere una fuerte y alta capacidad tintórea en estado puro. (Fennema, 2000).
Se ha observado que las betacianinas exhiben un máximo de absorción de luz aproximadamente a 537 – 538 nm. Y las betaxantinas en 480 nm. (Schwartz y Von Elbe, 1980), determinarón la absorbancia molar de la betalaina con un valor de 60 500 litro mol1 cm1; convirtiendo la absorbancia molar, al coeficiente ideal de extinción (E1cm1%
) se obtiene un valor de 1120% mol-1 cm-1 que se usa para calcular la concentración real de la betalaina, y para la betaxantina se ha determinado un valor de 750 y λmax=478 nm (Piatelli, 1969).
2.6.3. Propiedades químicas
Las betalaínas son compuestos orgánicos solubles en agua, con peso molecular entre 400 y 500. La estructura de las betalainas es diferente a la de otros pigmentos encontrados en el reino vegetal, ya que esta contiene nitrógeno. A la fecha se conocen alrededor de 50 betacianinas y de 25 betaxantinas y todas ellas poseen la misma estructura básica, formada por la condensación de una amida primaria o secundaria como el triptófano y un aldehído llamado ácido betalámico. Las betalainas están formadas por dos tipos de pigmentos, las rojas – violeta denominadas betacianinas y los amarillos denominados betaxantinas. (Lock, 1997).
El color de las betalainas se atribuye a sus estructuras en resonancia: si R o R´ no proyecta la resonancia, el compuesto es amarillo y se denomina betaxantinas; si R o R´ proyectan resonancia, el compuesto es rojo y se llaman betacianinas. (Fennema, 2000).
2.6.4. Clasificación de las betalaínas a. Betacianinas
Son pigmentos de color rojo violeta, son más estables que las betaxantinas, se consideran glucósidos, su principal componente es la betanina (hasta un 95% del total de las betacianinas en la beterraga). Todas las betacianinas pueden ser derivadas de dos núcleos básicos, la betanidina (Figura 4) y la isobetanidina (Figura 5), por glicosidación de uno de los grupos hidroxilos localizados en la posición cinco o seis. (Coultate, 1984).
En las betacianinas, la conjugación se extiende a un sustituyente aromático y el cromóforo muestra un desplazamiento batocrómico hasta 540 nm. La betacianina más conocida es la betanina. La betanina se isomeriza fácilmente a isobetanina por calentamiento.
En medio alcalino se hidroliza produciendo ciclodopa – 5 – 0 – glicósido y ácido betalámico. (Wong, 1989).
Las betalainas son pigmentos que no se ve afectado por ácidos monocarboxílicos como el ácido láctico y el ácido acético a concentraciones de 100 ppm y 5.9%, respectivamente, pero varios cationes metálicos, principalmente el cobre, aceleran su degradación. Los antioxidantes como el α – tocoferol y el ácido ascórbico no tienen efecto protector sobre las betalainas a concentraciones de 100 ppm; sin embargo, cuando las concentraciones se elevan a 1000 ppm se reduce la estabilidad del pigmento debido a que el tocoferol y la vitamina C funcionan como prooxidantes a estas concentraciones. Algunos
secuestrantes de metales como los ácidos etilendiaminotetraacético (EDTA) y el cítrico aumentan 50% la estabilidad de las betalainas. La mitad de los aminoácidos en estos compuestos son glutamina y acido glutámico. (Acosta, 2000).
b. Betaxantinas
Son pigmentos amarillos relacionados estructuralmente con las betacianinas, absorben a una longitud de onda máxima de 480 nm. El compuesto prototipo que representa la presencia natural de betaxantinas es la indicaxantina, aislada del fruto del cactus Opuntia ficus – indica, su aislamiento y análisis estructural confirmo la sospecha de una relación estructural entre las dos clases de pigmentos de las cactáceas. (Wong, 1989).
Las betaxantinas, han sido poco estudiadas, debido principalmente a que son más difíciles de aislar, pero se tienen
Figura 4. Estructura química de la betanina.
Figura 5. Estructura de la isobetanina.
indicios de que son mucho más lábiles que las betacianinas.
(Rodríguez, 1985).
Las betaxantinas, se caracterizan por tener grupos R Y R´ que no extienden la conjugación del cromóforo 1,7–diazaheptametino;
mientras que en las betacianinas, la conjugación está extendida con un anillo aromático sustituido, de la remolacha se han aislado dos betaxantinas llamadas vulgaxantina I y II (Figura 6). Ambas difieren en que la prolina ha sido sustituida por glutamina y ácido glutámico, respectivamente. También han sido aisladas varias miraxantinas. (Lock, 1997).
Figura 6. Estructura de las betaxantinas.
2.6.5. Biosíntesis de las betalainas
La dihidropiridina presente en todas las betalainas es sintetizado invivo a partir de dos moléculas de L- 5,6 – dihidroxifenilalanina (L – dopa), una de las cuales sufre un desdoblamiento oxidativo del 4,5 extradiol y la reciclización (Figura 7), se observa la biosíntesis de las betalainas .El producto del desdoblamiento y posterior reciclización ha sido identificado como ácido betalámico Una enzima cataliza la
conversión de la L – dopa a ácido betalámico. (Jackman y Smith, 1992).
La subsiguiente condensación del ácido betalámico con la ciclodopa produce la betanidina, y con otras aminas o amino ácidos diferentes de la ciclodopa, produce las betaxantina (Lock, 1997).
Figura 7. Biosintésis de las betalaínas.
2.6.6. Factores que gobiernan la estabilidad de las betalaínas
Al igual que otros pigmentos naturales, las betalaínas se ven afectadas por diversos factores como la luz, pH, oxigeno, temperatura, metales, actividad de agua, ácidos orgánicos, cationes, antioxidantes y secuestrantes. Las betalaínas son muy termolábiles y su velocidad de degradación se incrementa con la temperatura, siendo las betaxantinas mucho más sensibles que las betacianinas.
(Rodriguez, 1985).
Fuente: Herbach (2006).
Figura 8. Factores que gobiernan la estabilidad de las betalainas.
La termolabilidad de las betalainas es probablemente el factor que más restringe su uso como colorante de alimentos; en general, la estabilidad térmica es mayor entre pH 5 y 6 en la presencia de oxígeno, y entre pH 4 y 5 en ausencia de oxígeno. La exposición de las betalainas a la luz UV y luz visible también producen su degradación. (Lock, 1997).
a. Calor y/o acidez
Bajo condiciones alcalinas suaves las betalainas se degradan a ácido betalámico y ciclo dopa-5-0-glucosido. Si se calienta fuertemente se acelera la hidrolisis de las betalainas en solución y se produce ácido betalámico y ciclo dopa-5-0-glucosido, pero esta reacción es parcialmente reversible de acuerdo con el pH.
Ambos productos de degradación son sensibles al oxígeno y el ácido betalámico es afectado a condiciones ácidas o alcalinas fuertes. (Badui, 2006).
En vista de que las betalainas, poseen la misma estructura general, el mecanismo de degradación de betacianinas debería emplearse para las betaxantinas. La degradación de las betalainas a ácido betalámico y ciclo dopa-5-0-glucosido muestra ser reversible y por lo tanto la regeneración parcial del pigmento
Alto contenido de pigmento.
Alto grado de glucosilación.
Baja actividad de agua.
pH de 3 a 7.
Antioxidantes.
Agentes quelantes.
Baja temperatura.
Oscuridad.
+
Estabilidad-
Bajo contenido de pigmento.
Bajo grado de
glucosilación.
Alta actividad de agua.
pH de <3 o > 7.
Cationes metálicos.
Alta temperatura.
Luz.
ocurre siguiendo la termodegradación del pigmento. El mecanismo propuesto para la regeneración de las betalainas requiere una condensación de la base de Schiff del grupo aldehído del ácido betalámico y del amino nucleófilico de ciclo dopa-5-0-glucosido. Un modelo cinético de degradación de betalainas, el cual describe la reversibilidad de la reacción de degradación, predice la cantidad de betalaina que puede degradarse y regenerarse bajo varias condiciones experimentales.
El ácido betalámico muestra ser más estable a pH neutro y el ciclo dopa-5-0-glucosido muestra serlo en condiciones acidas; por lo tanto la regeneración de las betalainas es maximizada en un rango de pH entre 4 y 5. (Lugo, 1998).
Figura 9. Degradación reversible de la betalainas (Fennema, 2000).
Figura10. Degradación de las betalainas en medio ácido y/o por calor.
b. Efecto del oxígeno y luz
Otro factor importante que contribuye a la degradación de las betalainas es la presencia de oxígeno. En disoluciones que contienen un exceso molar de oxigeno respecto a la betalainas, la perdida de betalainas sigue la cinética de una reacción de primer orden. La degradación de las betalainas se desvía de la cinética de primer orden cuando la concentración molar de oxigeno se reduce hasta casi la de la betanina. En ausencia de oxígeno, la estabilidad aumenta. El oxígeno molar se ha implicado como el agente activo de la degradación oxidativa de las betalainas. Las especies de oxigeno activo, como el oxígeno simple o el anión superóxido, no participan en este proceso. La degradación de las betalainas en presencia de oxigeno depende del pH. La oxidación de las betalainas se acelera en presencia de la luz. (Fennema, 2000).
c. Efecto del pH
La estabilidad de las betalainas está influenciado por el pH, para la betacianina se ha determinado que a:
pH 3 a 7 el color rojo de la solución permanece inalterado con un λmáx. de absorción entre 537–538 nm.
pH < 3 el color cambia a violeta y el λmáx. es desplazado a 534–536 nm, ocurriendo un decrecimiento en la intensidad.
pH > 7 el color de la solución se hace más azulado, habiendo un desplazamiento batocrómico en el λmáx., siendo mayor el efecto a pH 9 donde el λmáx. ocurre a 543-544 nm.
pH > 10 hay un decrecimiento en intensidad en el λmáx. de 540-550 nm y hay incremento en la absorción a 400- 460 nm debido a la liberación del ácido betalámico, el cual es amarillo; por lo que hay un cambio de color azul a amarillo como resultado de la hidrolisis alcalina de betanina a ácido betalámico y ciclodopa- 5-0-glucosido. (Lock, 1997).
Fuente: Lock (1997).
Figura 11. Espectro de la betacianina a pH 2, 5 y 9.
d. Efecto de los cationes metálicos
Varios estudios han demostrado que los iones ferroso, férrico y cúprico promueven la decoloración del pigmento en productos de beterraga. La adición de iones cúpricos a las betalainas en solución resulta en una inmediata perdida de color. Se determinó que la perdida de color fue por la posible formación de complejos de betalainas con iones cobre. En una investigación de formación de complejos de betanina y betanidina, solo los iones cúprico, cuproso y mercúrico causaron inmediato cambio de color; estos cambios de color son más notables con betanidina. Todas las reacciones de degradación se aceleran por acción catalítica de algunos metales, principalmente cobre. (Badui, 2006).
e. Efecto de antioxidantes
La inestabilidad de las betalainas al oxigeno es una de las limitantes de su uso como colorante alimenticio. La adición de antioxidantes debe por lo tanto resultar en mejoramiento de la estabilidad. La adición de ácido ascórbico a jugo de beterraga concentrado o polvo de extracto de beterraga resulta en mejoramiento de la estabilidad del color, el ácido ascórbico protege el color rojo aun cuando es expuesto a tratamientos drásticos como esterilización. El ácido ascórbico ha sido reportado como el mejor estabilizante para garambullo (Mirtillocactus geometrizans). (García, 1998).
Resultados en la literatura reportan marcadas diferencias entre ácido ascórbico e isoascórbico como estabilizadores de las betalainas. El ácido isoascórbico ha sido reportado como el agente estabilizante y antioxidante más efectivo, en presencia de trazas de cationes metálicos. Los cationes Cu++ y Fe++ actúan como catalizadores en la oxidación de ácido ascórbico por
oxigeno molecular. En presencia de un quelante metálico (ácido etilendiaminotetraacético o ácido cítrico) la cantidad de oxigeno se reduce (Reynoso, 1997).
Los antioxidantes fenólicos como (butilhidroxianisol, butilhidroxitolueno y α-tocoferol), que inhiben la oxidación en cadena por radicales libres, el sulfito, metabisulfito y tiosulfito de sodio, el ácido tiopropionico y la cisteína no son efectivos para mantener la estabilización de las betalainas. Estos resultados confirman que las betalainas no se degrada por mecanismos de oxidación por radicales libres (Lugo, 1998).
f. Efecto de secuestrantes
La presencia de ácido etilendiaminotetraacético, en niveles bajos (1 ppm), en solución incrementa la estabilidad de las betalainas.
El efecto es pH dependiente siendo más efectivo entre pH 2 y 5.
El mecanismo por el cual el ácido etilendiaminotetraacético reduce la oxidación de las betalainas puede ser explicado en parte por su habilidad para quelar cationes metálicos polivalentes.
También protege a las betalainas por directa interacción con su centro electrofílico. (Lugo, 1998).
g. Efecto de actividad de agua
Las betalainas se vuelven más inestables a medida que aumenta la actividad de agua y el contenido de humedad de alimento. La degradación de las betalainas requiere la hidrolisis de la molécula de betalaina a ciclodopa-5-0-glucosido y ácido betalamico. Esta reacción es altamente dependiente de la disponibilidad de agua, por consiguiente, un decremento en la actividad de agua corresponde a una menor degradación de betalainas. Fue especulado que junto con el decremento de agua disponible, se
reduce la movilidad de reactantes y la solubilidad de oxigeno molecular. (Badui, 2006).
2.6.7. Identificación de betalainas
Las betalainas pueden identificarse tentativamente a partir de su comportamiento cromatográfico electroforético. Cada pigmento posee una movilidad electroforética característica, entre 0,30 y 1,78 relativa a la betanina, usando medidas a pH 4,5 y 2,4. La información obtenida puede corroborarse a través de los espectros de absorción en el visible; las betacianinas muestran absorción intensa entre 534 y 552 nm, y las betaxantinas entre 474 y 486 nm.
Las betalainas aciladas generalmente exhiben un segundo máximo de absorción en el UV, entre 260 a 320 nm. El espectro infrarrojo no es de mucha utilidad puesto que estos compuestos presentan casi los mismos grupos funcionales y sus espectros son muy parecidos.
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear podría dar buena información pero su uso está limitado por la baja solubilidad de estos compuestos en solventes orgánicos y por su fácil descomposición. (Lock, 1997).
2.6.8. Extracción, purificación y cuantificación de betalainas
Muchos ensayos para aislar betalainas se realizaron en la primera mitad de este siglo, pero recién se obtuvieron buenos resultados alrededor de los años 60 al usar electroforesis preparativa; se reportan otros métodos para la separación de betalainas del Beta vulgaris ; procedimiento de extracción – difusión, procedimiento de extracción fraccionada con etanol y más reciente aplicando la cromatografía liquida de alta performance (HPLC), esta última ha sido aplicada también para la separación de betaxantina. (Lock, 1997).
Bilyk (1981), propuso un método de separación empleando cromatografía en capa fina, con eluyentes polares como agua y etanol, con una acidificación previa de la muestra.
En lo que se refiere a la cuantificación de betalainas se emplea la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), la cual se permite realizar conjuntamente un análisis cualitativo y cuantitativo (Schwartz y Von Elbe, 1980).
La cuantificación de betalainas también se realiza usando técnicas espectrofotométricas (Stintzing, 2003; Yahia, 2008).
III. MATERIALES Y METODOS
3.1. Lugar de ejecución
El presente trabajo de investigación se realizó en los Laboratorios de Análisis de Alimentos, Análisis Instrumental, Microbiología de Alimentos de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional del Centro del Perú.
3.2. Materia prima
Para realizar el siguiente trabajo de investigación se utilizó ayrampo (Opuntia soehrensii Britton & Rose), recolectados en la provincia del colca, ubicado en el departamento de Arequipa - Perú.
3.3. Equipos y materiales 3.3.1. Equipos :
Autoclave.
Balanza analítica.
Campana desecadora.
Centrifuga.
Equipo de titulación.
Estufa.
Espectrofotómetro.
Potenciómetro.
Refrigeradora eléctrica.
Refractómetro.
Rotavapor RII, marca Büchi.
3.3.2. Materiales de vidrio:
Fiolas.
Pipetas.
Placas Petri.
Probetas.
Micropipetas.
Tips.
Tubos de ensayo.
Vaso de precipitación.
Termómetro.
Piceta.
Frascos con tapa.
3.3.3. Reactivos:
Agua destilada.
Etanol 96 %.
Hidróxido de sodio 0,1 N.
Hidróxido de sodio 1N.
Solución de fenolftaleína al 1%.
3.4. Métodos de evaluación utilizados a la materia prima 3.4.1. Caracterización física del ayrampo
Se realizó la caracterización física del ayrampo (Opuntia soehrensii Britton & Rose), evaluando la dimensión (largo y ancho) y el peso promedio tanto para la parte comestible (pulpa) como para el residuo (cáscara y semillas), para determinar el porcentaje de cada una de las fracciones del ayrampo, esto se realizó tomando 20 muestras de manera aleatoria. (Castillo Martínez, 2005)
3.4.2. Análisis químico proximal del ayrampo a. Determinación de humedad
Se determinó por pérdida de peso del producto sometido a desecación llevando las muestras a la estufa a 100 °C por 6 horas hasta obtener un peso constante (AOAC, 1999).
b. Determinación de proteína
Método semi – Micro Kjendahl, utilizando el factor 6,25 para llevar el nitrógeno a proteína total (AOAC, 1999).
c. Determinación de ceniza
Se determinó por calcinación de la muestra en mufla a 600 °C por 6 horas (AOAC, 1999).
d. Determinación de grasa cruda
Se determinó por el método de Gerber, mediante el principio de la fuerza centrífuga y la diferencia de densidades. (AOAC, 1999).
e. Determinación de carbohidratos
Se obtuvo por diferencia {100%- (% humedad + % proteína + % fibra + % grasa + % ceniza)}. (AOAC, 1999).
3.4.3. Características fisicoquímicos de la pulpa de ayrampo
Se hicieron análisis por triplicado de pH, sólidos solubles, % de acidez titulable, densidad e índice de madurez de la pulpa de ayrampo.
a. Determinación de pH y acidez
La medición del pH se determinó haciendo uso del potenciómetro previa calibración, se enjuago el electrodo con agua destilada y se secó cuidadosamente, el potenciómetro se calibro con buffer pH 7 y buffer pH 4. Se tomó una muestra de 30 ml de pulpa de ayrampo (Opuntia soehrensii Britton &Rose), posteriormente el electrodo se introdujo en la muestra y se leyó el pH, esto se realizó por triplicado. (AOAC, 1999).
La acidez titulable fue cuantificada homogenizando 10 gr de pulpa con 90 ml de agua destilada la muestra se filtró. La determinación se hizo por titulación con una solución valorada de hidróxido de
sodio (NaOH) al 0,1 N, se transfirieron 50 ml de la muestra a un vaso de precipitación se adicionaron 3 gotas de solución de fenolftaleína, y se registró la acidez en el momento en el que el extracto de ayrampo junto con los ml de NaOH gastados alcanzaron en el potenciómetro un pH de 8,20. (AOAC, 1999).
b. Determinación de los sólidos solubles
Los sólidos solubles totales se expresaron como °Brix, se determinaron con un refractómetro digital de mano, en el cual se colocaron tres gotas de pulpa de ayrampo (Opuntia soehrensii Britton &Rose) en el refractómetro previa calibración del equipo con agua destilada, para posteriormente efectuar su lectura. (AOAC, 1999).
c. Determinación de la densidad
La determinación de la densidad de la pulpa de ayrampo se realizó mediante el uso del picnómetro. (AOAC, 1999).
d. Determinación del índice de madurez
El índice de madurez de la pulpa de ayrampo se determinó de la relación de sólidos solubles entre la acidez total titulable. (M.
Gallo,1999).
3.5. Metodología y procedimiento de trabajo 3.5.1. Obtención del colorante de ayrampo
a. Recepción de materia prima
Se seleccionaron frutos que no presentaban daños y libres de putrefacción.
b. Lavado de la materia prima
Se realizó un lavado con agua potable para eliminar impurezas presentes en la superficie, evitando su contaminación y para retirar las espinas facilitando su manipulación.
c. Escaldado
Esta operación se realizó en la autoclave a una presión de 15 Lb/pul2, por diez minutos y una temperatura de 50 °C, con la finalidad de fijar el color , reducir el número de microorganismos presentes en la superficie e inactivar enzimas.
d. Pelado
Esta operación se realizó con la finalidad de separar la cáscara de la pulpa, se hizo de forma manual con la ayuda de un cuchillo retirando todos los restos de la pulpa que quedaban adheridos a la cáscara.
e. Extracción por presión
Para la obtención del extracto de ayrampo se utilizó una prensa manual para separar la pulpa de las semillas.
f. Filtración
El extracto obtenido se filtró a través de varias capas de una tela fina para la eliminación de los sólidos en suspensión y de las semillas que pudieron quedar.
g. Purificación del colorante
La purificación del colorante se realizó con etanol 96% disolvente utilizado para la obtención de principales pigmentos presentes en otros frutos de cactáceas como son clorofilas y carotenoides (Lugo, 1998 y Yizhong, 2001), la relación de extracto de ayrampo y solvente fue de 1:1. El etanol 96%, sirvió además como un agente conservante y ayudó a la precipitación de la pectina presente en el extracto.
h. Centrifugación
El extracto etanólico obtenido fue centrifugado a 6000 rpm, durante 30 minutos con la finalidad de separar todas aquellas partículas que le daban turbidez al extracto, el sobrenadante con los sólidos sedimentados fueron separados, y posteriormente eliminados.
i. Separación del solvente
Para la separación del solvente se utilizó el rotavapor, a 40 rpm, 50 °C de temperatura por un tiempo de 20 minutos.
j. Concentración al vacío
El extracto obtenido se concentró al vacío hasta alcanzar un nivel aproximado de 40 °Brix, esto se realizó a 40 rpm, 50 °C de temperatura por 90 minutos aproximadamente, en lotes de 90 ml, esta concentración se hizo con la finalidad de permitir su incorporación en cantidades pequeñas en los sistemas alimenticios y de mejorar su conservación mediante el incremento de los sólidos solubles.
Figura 12. Diagrama de flujo para la obtención del colorante.
Separación del solvente
Concentración al vacío Purificación
Centrifugación Extracción por presión
Pelado Escaldado
Recepción de materia prima
Filtrado Separación de
la cascara
Obtención del extracto de ayrampo
Eliminación total de semillas y de sólidos en
suspensión
Etanol de 96% (relación de extracto y solvente 1:1)
6000 rpm; Ɵ = 30 min.
40 rpm; T= 50 0C; Ɵ = 20 min.
40 rpm; T= 50 0C; Ɵ = 90 min.
Ayrampo
p = 15 Lb/pulg2; Ɵ = 10 min T = 50 oC
Almacenado
