3.1. Lugar de ejecución
El presente trabajo de investigación se realizó en los Laboratorios de Análisis de Alimentos, Análisis Instrumental, Microbiología de Alimentos de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional del Centro del Perú.
3.2. Materia prima
Para realizar el siguiente trabajo de investigación se utilizó ayrampo (Opuntia soehrensii Britton & Rose), recolectados en la provincia del colca, ubicado en el departamento de Arequipa - Perú.
3.3. Equipos y materiales 3.3.1. Equipos :
Autoclave.
Balanza analítica.
Campana desecadora.
Centrifuga.
Equipo de titulación.
Estufa.
Espectrofotómetro.
Potenciómetro.
Refrigeradora eléctrica.
Refractómetro.
Rotavapor RII, marca Büchi.
3.3.2. Materiales de vidrio:
Fiolas.
Pipetas.
Placas Petri.
Probetas.
Micropipetas.
Tips.
Tubos de ensayo.
Vaso de precipitación.
Termómetro.
Piceta.
Frascos con tapa.
3.3.3. Reactivos:
Agua destilada.
Etanol 96 %.
Hidróxido de sodio 0,1 N.
Hidróxido de sodio 1N.
Solución de fenolftaleína al 1%.
3.4. Métodos de evaluación utilizados a la materia prima 3.4.1. Caracterización física del ayrampo
Se realizó la caracterización física del ayrampo (Opuntia soehrensii Britton & Rose), evaluando la dimensión (largo y ancho) y el peso promedio tanto para la parte comestible (pulpa) como para el residuo (cáscara y semillas), para determinar el porcentaje de cada una de las fracciones del ayrampo, esto se realizó tomando 20 muestras de manera aleatoria. (Castillo Martínez, 2005)
3.4.2. Análisis químico proximal del ayrampo a. Determinación de humedad
Se determinó por pérdida de peso del producto sometido a desecación llevando las muestras a la estufa a 100 °C por 6 horas hasta obtener un peso constante (AOAC, 1999).
b. Determinación de proteína
Método semi – Micro Kjendahl, utilizando el factor 6,25 para llevar el nitrógeno a proteína total (AOAC, 1999).
c. Determinación de ceniza
Se determinó por calcinación de la muestra en mufla a 600 °C por 6 horas (AOAC, 1999).
d. Determinación de grasa cruda
Se determinó por el método de Gerber, mediante el principio de la fuerza centrífuga y la diferencia de densidades. (AOAC, 1999).
e. Determinación de carbohidratos
Se obtuvo por diferencia {100%- (% humedad + % proteína + % fibra + % grasa + % ceniza)}. (AOAC, 1999).
3.4.3. Características fisicoquímicos de la pulpa de ayrampo
Se hicieron análisis por triplicado de pH, sólidos solubles, % de acidez titulable, densidad e índice de madurez de la pulpa de ayrampo.
a. Determinación de pH y acidez
La medición del pH se determinó haciendo uso del potenciómetro previa calibración, se enjuago el electrodo con agua destilada y se secó cuidadosamente, el potenciómetro se calibro con buffer pH 7 y buffer pH 4. Se tomó una muestra de 30 ml de pulpa de ayrampo (Opuntia soehrensii Britton &Rose), posteriormente el electrodo se introdujo en la muestra y se leyó el pH, esto se realizó por triplicado. (AOAC, 1999).
La acidez titulable fue cuantificada homogenizando 10 gr de pulpa con 90 ml de agua destilada la muestra se filtró. La determinación se hizo por titulación con una solución valorada de hidróxido de
sodio (NaOH) al 0,1 N, se transfirieron 50 ml de la muestra a un vaso de precipitación se adicionaron 3 gotas de solución de fenolftaleína, y se registró la acidez en el momento en el que el extracto de ayrampo junto con los ml de NaOH gastados alcanzaron en el potenciómetro un pH de 8,20. (AOAC, 1999).
b. Determinación de los sólidos solubles
Los sólidos solubles totales se expresaron como °Brix, se determinaron con un refractómetro digital de mano, en el cual se colocaron tres gotas de pulpa de ayrampo (Opuntia soehrensii Britton &Rose) en el refractómetro previa calibración del equipo con agua destilada, para posteriormente efectuar su lectura. (AOAC, 1999).
c. Determinación de la densidad
La determinación de la densidad de la pulpa de ayrampo se realizó mediante el uso del picnómetro. (AOAC, 1999).
d. Determinación del índice de madurez
El índice de madurez de la pulpa de ayrampo se determinó de la relación de sólidos solubles entre la acidez total titulable. (M.
Gallo,1999).
3.5. Metodología y procedimiento de trabajo 3.5.1. Obtención del colorante de ayrampo
a. Recepción de materia prima
Se seleccionaron frutos que no presentaban daños y libres de putrefacción.
b. Lavado de la materia prima
Se realizó un lavado con agua potable para eliminar impurezas presentes en la superficie, evitando su contaminación y para retirar las espinas facilitando su manipulación.
c. Escaldado
Esta operación se realizó en la autoclave a una presión de 15 Lb/pul2, por diez minutos y una temperatura de 50 °C, con la finalidad de fijar el color , reducir el número de microorganismos presentes en la superficie e inactivar enzimas.
d. Pelado
Esta operación se realizó con la finalidad de separar la cáscara de la pulpa, se hizo de forma manual con la ayuda de un cuchillo retirando todos los restos de la pulpa que quedaban adheridos a la cáscara.
e. Extracción por presión
Para la obtención del extracto de ayrampo se utilizó una prensa manual para separar la pulpa de las semillas.
f. Filtración
El extracto obtenido se filtró a través de varias capas de una tela fina para la eliminación de los sólidos en suspensión y de las semillas que pudieron quedar.
g. Purificación del colorante
La purificación del colorante se realizó con etanol 96% disolvente utilizado para la obtención de principales pigmentos presentes en otros frutos de cactáceas como son clorofilas y carotenoides (Lugo, 1998 y Yizhong, 2001), la relación de extracto de ayrampo y solvente fue de 1:1. El etanol 96%, sirvió además como un agente conservante y ayudó a la precipitación de la pectina presente en el extracto.
h. Centrifugación
El extracto etanólico obtenido fue centrifugado a 6000 rpm, durante 30 minutos con la finalidad de separar todas aquellas partículas que le daban turbidez al extracto, el sobrenadante con los sólidos sedimentados fueron separados, y posteriormente eliminados.
i. Separación del solvente
Para la separación del solvente se utilizó el rotavapor, a 40 rpm, 50 °C de temperatura por un tiempo de 20 minutos.
j. Concentración al vacío
El extracto obtenido se concentró al vacío hasta alcanzar un nivel aproximado de 40 °Brix, esto se realizó a 40 rpm, 50 °C de temperatura por 90 minutos aproximadamente, en lotes de 90 ml, esta concentración se hizo con la finalidad de permitir su incorporación en cantidades pequeñas en los sistemas alimenticios y de mejorar su conservación mediante el incremento de los sólidos solubles.
Figura 12. Diagrama de flujo para la obtención del colorante.
Separación del solvente
Concentración al vacío Purificación
Centrifugación Extracción por presión
Pelado Escaldado
Recepción de materia prima
Filtrado Separación de
la cascara
Obtención del extracto de ayrampo
Eliminación total de semillas y de sólidos en
suspensión
Etanol de 96% (relación de extracto y solvente 1:1)
6000 rpm; Ɵ = 30 min.
40 rpm; T= 50 0C; Ɵ = 20 min.
40 rpm; T= 50 0C; Ɵ = 90 min.
Ayrampo
p = 15 Lb/pulg2; Ɵ = 10 min T = 50 oC
Almacenado
3.6. Métodos de evaluación utilizados en el colorante.
3.6.1. Características fisicoquímicos del colorante
Se hicieron análisis por triplicado de pH, sólidos solubles, % de acidez titulable y densidad.
a. Determinación de pH y acidez
La medición del pH se determinó haciendo uso del potenciómetro previa calibración, se enjuago el electrodo con agua destilada y se secó cuidadosamente, el potenciómetro se calibro con buffer pH 7 y buffer pH 4. Se tomó una muestra de 30 ml del colorante de ayrampo, se introdujo el electrodo en la muestra y posteriormente se leyó el pH. (AOAC, 1999).
La determinación de la acidez se hizo por titulación con una solución valorada de hidróxido de sodio (NaOH) al 0,1 N, se tomó 50 ml de la muestra a un vaso de precipitación se adicionaron 3 gotas de solución de fenolftaleína, y se registró la acidez en el momento en el que el colorante junto con los ml de NaOH gastados alcanzaron en el potenciómetro un pH de 8,20. (AOAC, 1999).
b. Determinación de los sólidos solubles
Los sólidos solubles se expresaron como °Brix, se determinaron con un refractómetro digital de mano, en el cual se colocaron tres gotas del colorante en el refractómetro previa calibración del equipo con agua destilada, posteriormente se leyeron el ° Brix. (AOAC, 199).
c. Determinación de la densidad
La determinación de la densidad del colorante se realizó mediante el uso del picnómetro. (AOAC, 1999).
3.6.2. Identificación de los pigmento presente en el colorante
Los pigmentos presentes en el colorante se identificaron por medio de espectrofotometría, al comparar sus picos de absorción máxima con los de referencias (Yizhong, 2001) con la finalidad de caracterizar el grupo químico al cual pertenecen. Para hacer las lecturas en el
espectrofotómetro se utilizó 20 µl de colorante enrazado con agua destilada al volumen de la celda (2 ml).
3.6.3. Cuantificación de los pigmento presente en el colorante
Para la cuantificación de los pigmentos presentes en el colorante se utilizó el método espectrofotométrico, propuesta por Castellano- Santiago y Yahia (2008), con este método se determinaron las betacianinas y las betaxantinas sin necesidad de separarlas debido a que la estabilidad de estas disminuyen al ser separada. Las lecturas fueron realizadas en el espectrofotómetro en celdas de un centímetro.
La cantidad de pigmento presente en el colorante obtenido a partir de la pulpa fue calculada con la siguiente ecuación.
BC (mg /L) = (A * FD * PM * 1000) (ε * l)-1 Dónde:
BC = contenido de betacianina o betaxantina. (mg/L).
A = absorbancia. (nm).
FD = factor de dilución.
PM = peso molecular (550 g/mol betacianina y 308 g/mol betaxantina).
ε = coeficiente de extinción molar. (L.mol/cm).
l = anchura de la cubeta del espectrofotómetro. (cm).
Los valores de extinción molar (ε) utilizada para determinar la cantidad de pigmento fueron de 60000 L.mol/cm, para las betacianinas y de 48000 L.mol/cm para las betaxantinas a sus respectivas absorbancias máximas (538 nm para las betacianinas y 480 nm para las betaxantinas).
El porcentaje de pigmento retenido (%P.R.) fue calculado de acuerdo a la siguiente ecuación. Castellanos-Santiago y Yahia (2008),
% P.R. = (C.P.Tx / C.P.T0) * 100 Dónde:
% P.R = porcentaje de pigmento retenido.
C.P.Tx = contenido de pigmento en el tiempo “x” (mg / L).
C.P.T0 = contenido de pigmento en el tiempo “0” (mg / L).
3.6.4. Evaluación de la estabilidad del colorante
La evaluación de la estabilidad del colorante se llevó a cabo durante cuatro semanas haciendo el monitoreo cada semana, en el que se realizaban las medidas de la absorbancia. El colorante obtenido fue sometido a la combinación de dos diferentes factores fisicoquímicos como fueron:
Temperatura: se probaron tres diferentes temperaturas (4 °C, 19
°C, 63 °C). Las cuales fueron escogidas debido a que la mayoría de los alimentos se almacenan a estas temperaturas o en caso de tener algún tratamiento térmico se pueden alcanzar temperaturas como 63
°C. Para mantener la temperatura de 4 °C, se utilizó una refrigeradora, los 19 °C correspondieron a las muestras mantenidas a temperatura ambiente y para la de 63 °C se utilizó una estufa.
pH: se probaron tres valores diferentes de pH (4, 5 y 6), porque la mayoría de alimentos consumidos mantienen estos valores de pH.
Para ajustar el pH del colorante a los valores requeridos se utilizó hidróxido de sodio al 1 N.
En el cuadro 4, se pueden observar cómo se codificaron las muestras para realizar la evaluación de la estabilidad del colorante.
Cuadro 4. Códigos de las muestras para la evaluación de la estabilidad del colorante.
Dónde:
A = Temperatura. A1 = 4 °C A2 = 19 °C A3 = 63 ° C B = pH. B1 = 4 B2 = 5. B3 = 6.
3.7. Diseño estadístico experimental
El tipo de diseño estadístico experimental que se utilizó para la evaluación de la estabilidad del colorante de ayrampo fue el diseño completamente al azar (DCA), con arreglo factorial, este diseño se ajusta al trabajo de investigación porque considera el efecto de cada factor que a su vez están constituidos por tratamientos.
A continuación se presenta el modelo estadístico y simbología del presente diseño experimental, modelo aditivo lineal para la evaluación de la estabilidad.
Prueba Código
1 T4°C pH4 A1B1 2 T4°C pH5 A1B2 3 T4°C pH6 A1B3 4 T19°C pH4 A2B1 5 T19°C pH5 A2B2 6 T19°C pH6 A2B3 7 T63°C pH4 A3B1 8 T63°C pH5 A3B2 9 T63°C pH6 A3B3
Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk
Dónde:
Yijk = Observación del experimento (% retención de pigmento) µ = Media poblacional
αi = efecto debido al i-ésimo nivel del factor A, (T = 4 °C, 19 °C, 63 °C).
βj = efecto debido al j-ésimo nivel del factor B, pH (4, 5 y 6).
(Αβ)ij =efecto de interacción en la combinación ij ( T vs pH).
εijk= Error experimental.
Figura 13. Diseño experimental para la evaluación de la estabilidad del colorante.
La evaluación de la estabilidad del colorante de ayrampo a tres valores diferentes de temperatura y pH, fue realizada durante cuatro semanas, haciendo las lecturas correspondientes de la absorbancia en el espectrofotómetro cada semana.
pH1 pH2 pH3
pH1 pH2 pH3
0T2
Extracto concentrado
0T1 0T3
pH1 pH2 pH3
3.8. Análisis estadístico
Para la evaluación de la estabilidad del colorante de ayrampo (Opuntia soehrensii Britton and Rose), se planteó un diseño experimental factorial 3*3, que se realizó por triplicado, donde los factores que variaron fueron:
temperatura y pH; el porcentaje de pigmento retenido fue la variable de respuesta.
Posteriormente se realizó el análisis estadístico para la interpretación de los resultados de los datos obtenidos cada semana durante las cuatro semanas de evaluación de la estabilidad del colorante, se procedió a realizar un análisis de varianza (ANVA) para cada tratamiento así como su correspondiente prueba de tukey al 5% de significación para determinar si existe diferencia entre tratamientos.