1 2 3 ACTIVADORES FIBRINOLÍTICOS

Los activadores fisiológicos del plasminógeno, el tPA y la uPA, representan el papel dual del sistema fibrinolítico, ya que mientras que la activación del tPA es importante para el proceso de fibrinolisis, la uPA modula el proceso proteolítico pericelular de la MEC. Así, a pesar de que ambos activadores poseen actividades enzimáticas comunes, parecen desempeñar distintos papeles en el organismo.

El tPA es una serín-proteasa que se sintetiza fundamentalmente en las células endoteliales y está presente en el plasma a bajas concentraciones, pudiéndose detectar niveles antigénicos de tPA circulante del orden de 5 ng/ml. En su mayor parte se puede encontrar formando complejos con el PAI-1 y alrededor del 5% se puede detectar en forma libre y activa en el plasma.

Una de las características más interesantes del sc-tPA es su baja actividad enzimática en un sistema purificado. Sin embargo, la eficacia catalítica de la conversión del plasminógeno a plasmina se incrementa unas 1.500 veces en presencia de fibrina o de fragmentos de ésta [109]. Esto se debe a que la fibrina actúa como superficie sobre la cual se unen secuencialmente el tPA y el plasminógeno para formar un complejo ternario. La gran afinidad del tPA por el plasminógeno en presencia de fibrina da como resultado una eficiente activación del plasminógeno a plasmina en la zona del coágulo, mientras que al mismo tiempo la activación en el plasma circulante permanece muy reducida. Así pues, la principal función del tPA parece estar asociada con la fibrinólisis a nivel endotelial, siendo su actividad proteolítica tisular de menor importancia que la de la uPA. No se han observado diferencias significativas en las actividades de ambas formas en presencia de fibrina [110]. 1. 2. 3. 1. Activador del plasminógeno tipo uroquinasa (uPA)

El gen de la uPA humana está localizado en la banda cromosómica 10q24 [111] y contiene 11 exones a lo largo de 6,4 Kb [112]. La uPA es una serín-proteasa de tipo tripsina, aislada inicialmente de la orina humana en forma de doble cadena (tc-uPA). Sin embargo, y como en el caso del tPA, la uPA se sintetiza inicialmente como una molécula de una sóla

cadena polipeptídica (sc-uPA) [113] compuesta por 411 aminoácidos y con una masa molecular de 54 KDa.

Tras digestión parcial por parte de la plasmina o la calicreína, a nivel del enlace peptídico Lys158-Ile159, la sc-uPA se convierte en la forma de doble cadena tc-uPA, denominada también uroquinasa de elevada masa molecular (HMW-uPA), formada por una cadena ligera A, que representa el extremo N-terminal del sc-uPA y que contiene 158 aminoácidos, y una cadena pesada B con 253 aminoácidos. En esta última se localiza el centro catalítico formado por la triada catalítica His204, Asp255 y Ser356, de tal modo que el puente disulfuro Cys194-Cys222 es esencial para mantener la actividad del enzima. Por su parte, la cadena ligera contiene una región homóloga al factor de crecimiento epidérmico (EGF) humano (residuos 9-45), y una región kringle (aminoácidos 45-134). La HMW-uPA puede ser escindida por la plasmina en una forma de uroquinasa de baja masa molecular (33 KDa) y enzimáticamente activa (LMW-uPA) y una molécula que no es enzimáticamente activa denominada ATF-uPA, que mantiene la capacidad de unirse al receptor de la uPA [114].

La concentración de sc-uPA en plasma es de 8 a 10 ng/ml y su vida media es de 5 a 8 minutos, siendo predominantemente metabolizada en el hígado.

Cuando se incuba sc-uPA con plasminógeno, en un sistema purificado, se genera rápidamente tanto tc-uPA como plasmina. El análisis cinético de este proceso revela que se trata en realidad de una secuencia de tres reacciones [115, 116]. En la primera, el sc-uPA actúa directamente sobre el plasminógeno generando pequeñas cantidades de plasmina. A continuación, la plasmina convierte el sc-uPA en tc-uPA, y ésta dirige finalmente la activación del plasminógeno.

A nivel celular, la uPA se une específicamente a su receptor (uPAR) expresado en diferentes tipos celulares [117]. Este receptor de superficie está formado por 283 aminoácidos que se anclan en la membrana por una cola glicosil fosfatidil inositol (GPI) [118, 119]. Este receptor de superficie parece jugar un papel central en la regulación de la proteolisis extracelular. Se han descrito variantes solubles del uPAR, denominadas suPAR,

las cuales se producen bien por splicing alternativo del mismo gen [120] o por eliminación de la cola GPI de la isoforma completa [121]. (Figura 1. 6).

Figura 1. 6. Modelo de unión de uPA a su receptor (uPAR). La molécula de uPA es secretada y se une con gran afinidad y especificidad al uPAR. Esta unión activa la uPA, limitando la actividad proteolítica en la superficie celular. Los componentes de la MEC se degradan por la plasmina, facilitando la migración celular y la angiogénesis. La vitronectina interacciona con el uPAR desencadenando una activación de la cascada de señal intracelular (modificado de http://www.wilex.de/R&D/uPA_Target.htm).

La unión de la uPA a su receptor permite la generación controlada de plasmina próxima a la superficie de las células, produciendose proteolisis en localizaciones muy específicas. Además, la uPA también es capaz de degradar la MEC en ausencia de plasminógeno [122]. Y tanto la uPA como la plasmina pueden activar a otras familias de proteasas, como las MMPs, de forma que este conjunto de proteasas actúan degradando eficazmente los componentes de la MEC. Así pues, las células portadoras del receptor uPAR, tras la unión de su ligando podrán invadir tejidos adyacentes e incluso entrar en la circulación sanguínea, con lo que pueden alcanzar localizaciones remotas. Esta proteolisis controlada modula la capacidad de migración e invasión de estas células al regular las interacciones entre ellas mismas y entre ellas y la membrana basal o la MEC [123]. Estos mecanismos regulan la migración celular en condiciones fisiológicas y patológicas, como

es el caso de la angiogénesis, la implantación embrionaria, la reacción inflamatoria, la cicatrización cutánea y la implantación de metástasis tumorales [124-126].

También, junto a la plasmina, la uPA posee la capacidad de activar y liberar factores de crecimiento unidos a la MEC o a la superficie celular, promoviendo crecimiento celular y angiogénesis. Por otra parte, la unión de la uPA a su receptor, uPAR, también tiene un efecto mitogénico [127], por lo que estos mecanismos son importantes para el proceso de regeneración tisular.

El uPAR podría actuar también como receptor de la MEC durante el proceso de adhesión celular [128], ya que es capaz de unirse a la vitronectina y a las integrinas [129, 130]. La uPA unida a su receptor también es susceptible de inhibición por los PAIs, aunque a una menor velocidad, lo que podría jugar un papel importante en el control de la activación del plasminógeno a nivel tisular y en la proteolisis de la MEC. Se cree que el uPAR puede incrementar la disponibilidad local de uPA debido a este enlentecimiento de la inhibición por el PAI-1 y la disminución de su eliminación.

La vía de la uPA juega, en general, un papel importante en la fisiología uterina [131] y, más concretamente, en el inicio de la menstruación [132]. La expresión de uPA está regulada por mecanismos paracrinos y factores esteroideos [133, 134]. La uPA puede ser inactivada por progesterona en cultivos de células endometriales estromales debido a un aumento de la expresión de PAI-1 y de uPAR en la superficie celular [129]. Por otra parte, se ha descrito una asociación de uPA a nivel de la membrana basal de la glándula endometrial en relación con la hiperplasia y el adenocarcinoma de endometrio [135, 136] y con el cáncer de ovario [137].

Regulación de la uPA

La transcripción de un gen está regulada principalmente por la actividad de unos factores nucleares específicos que gobiernan la frecuencia de inicio de la transcripción. Esos factores interaccionan con secuencias específicas situadas, generalmente, en la región 5' de los genes, modulando la actividad de la RNA polimerasa. En cuanto a la regulación de la uPA, se ha descrito que su promotor contiene una caja TATA (secuencia prácticamente

universal en los genes eucariotas de inicio de transcripción y característica de genes regulados) y una región de unas 200 bases rica en GC (característica de los genes de expresión constitutiva o housekeeping), donde se encuentran varias copias de la secuencia GGGCGG que es reconocida por el factor de transcripción SP1. La expresión del gen de la uPA se induce por distintas señales, entre las que se incluyen factores de crecimiento presentes en el suero, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el de fibroblastos (FGF), hormonas esteroides, la luz ultravioleta y cambios en la morfología celular [138- 140].

La región intensificadora más caracterizada del gen de la uPA se encuentra a unas - 2 Kb del punto de origen de la transcripción [141, 142]. Esta región está compuesta de un sitio Ets/AP1A, un sitio AP1B hacia 5´ del promotor y un conector cooperativo (COM) de 74 pb entre ambas regiones. Se ha demostrado que los factores de transcripción que se unen al sito Ets/AP1 son activados por miembros de las MAPK (“mitogen-activated protein kinases”) [143-145]. Se cree que el promotor de la uPA es muy sensible a una gran variedad de señales, ya que estas quinasas son activadas por distintas señales extracelulares como factores de crecimiento, citoquinas, estrés osmótico y radiación ultravioleta [146].

En la región 3’ no traducida (3´UTR) del mRNA de la uPA, (también en uPAR, PAI- 1, y PAI-2), se encuentra la secuencia ARE (“AU rich element”) [147, 148]. Esta secuencia, rica en AU, marca al mRNA para una degradación rápida disminuyendo su estabilidad. Se ha descrito un aumento en la estabilidad del mRNA de la uPA en células metastáticas del cáncer de mama (con una vida media de 17 h), debido sobre todo a una disminución de la degradación del mRNA de la uPA mediada por las secuencias ARE [149].

Fisiopatología de la uPA

El estudio de ratones transgénicos deficientes en uPA [124, 150] ha permitido conocer algunos aspectos del papel de la uPA in vivo. Al igual que ocurre con el tPA, una deficiencia de uPA no parece alterar el desarrollo embrionario ni la fertilidad, aunque la deficiencia combinada de ambos activadores del plasminógeno, tPA y uPA, sí que dificulta el proceso de ovulación. Además, ratones transgénicos deficientes en uPA [140]

presentan una mayor susceptibilidad a la trombosis, una reducida vascularización, una reducción de la activación de las plaquetas y una reducción de la capacidad de invasión tumoral.