Actividad antioxidante de los COS

La actividad antioxidante de los COS se determinó mediante diferentes métodos de atrapamiento de radicales libres, como el método DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidracil), el método ABTS (ácido 2,2’-azinobis-(3-etilbenzotiazolín)-6-sulfónico), y el método ORAC (del inglés Oxygen Radical Absorbance Capacity). Además se utilizó un método basado en la capacidad de reducir iones férricos (FRAP, del inglés Ferric Reducing Ability of Plasma). En todos los métodos propuestos se emplea como referencia la actividad antioxidante que presenta el Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico), un derivado sintético de la vitamina E, y los resultados se expresan como Capacidad Antioxidante en Equivalentes de Trolox (TEAC, del inglés Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) en µmol equivalentes de trolox/g de muestra de COS (µmol Eq. Trolox/g). Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.

7.2.1. Materiales

Materiales Casa comercial

- 1,1-difenil-2-picril-hidracil

- 2, 2'- Azobis (2-amidinopropano dihidrocloruro) - 2,4,6-tripiridil-s-triazina - Ácido 2,2’-azinobis-(3-etilbenzotiazolín) -6-sulfónico - Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil- croman-2-carboxílico - Cloruro de hierro - Fosfato de sodio - Persulfato potásico Sigma-Aldrich® - Metanol - 3’,6’-dihidroxifluorano Panreac®

67 7.2.2. Método DPPH

Este ensayo está basado en el método propuesto por Chen et al., (2009) con ligeras modificaciones llevadas a cabo en nuestro laboratorio. Se basa en la capacidad de neutralizar o “atrapar” radicales libres de DPPH, que se forman directamente al disolver DPPH en un medio orgánico. En su forma radical libre, el DPPH absorbe a 517 nm, y cuando es reducido por un antioxidante, esta absorción desaparece. Así se evaluó la capacidad antioxidante de los COS. Las muestras de COS se disolvieron al 1% (p/v) en agua Milli-Q y el DPPH se preparó a una concentración de 100 µM en metanol. A 250 µl de la solución de COS se le añadió 1 ml de la solución de DPPH, se agitó en vórtex y la mezcla se mantuvo en oscuridad a temperatura ambiente durante una hora. Transcurrido este periodo se realizaron medidas de absorbancia a 517 nm en un espectrofotómetro Specord® 205 (Analytik Jena, Alemania). Como patrón se utilizó una curva de Trolox en agua Milli-Q en un intervalo de concentraciones de 0 a 150 µM empleándose como blanco agua Milli-Q.

7.2.3. Método ABTS

Este ensayo está basado en el método propuesto por Re et al., (1999) con ligeras modificaciones llevadas a cabo en nuestro laboratorio. Se basa en la capacidad del persulfato potásico para generar radicales peroxilo que van a oxidar el ABTS, generando el radical catión ABTS·+, hidrosoluble y de intenso color. La capacidad antioxidante de los COS se evaluó mediante inhibición óptica, complementaria a la absorbancia, al reaccionar directamente con el radical de ABTS. Las muestras de COS se disolvieron al 1% (p/v) en agua Milli-Q y el reactivo ABTS se preparó a una concentración de 7 mM en etanol. A 10 ml de reactivo ABTS se le añadieron 176 µl de persulfato potásico 140 mM y la mezcla se mantuvo en oscuridad a temperatura ambiente con agitación (100 rpm) durante 14-16 horas. Transcurrido este tiempo, esta mezcla se diluyó con etanol hasta alcanzar un valor de absorbancia de 0,70 ± 0,02 a 734 nm equilibrado a 30°C. A 1 ml de mezcla de reactivo ABTS más persulfato se le añadieron 50 µl de la muestra de COS, se agitó con vórtex, y se mantuvo en oscuridad a 30°C durante 10 minutos. Transcurrido este periodo se realizaron medidas de absorbancia a 734 nm en un espectrofotómetro Specord® 205 (Analytik Jena, Alemania). Como patrón se utilizó una curva de Trolox en agua Milli-Q en un intervalo de concentraciones de 0 a 600 µM empleándose como blanco agua Milli-Q.

68 7.2.4. Método FRAP

Este ensayo está basado en el método propuesto por Benzie et al., (1996) y modificado por Pulido et al., (2000). Se basa en la capacidad que tiene el compuesto antioxidante para reducir el Fe3+ _{a Fe}2+_{. Así, mediante medidas de absorbancia, se evaluó la capacidad antioxidante de}

los COS para reducir el Fe3+ _{del complejo férrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) incoloro a la}

forma ferrosa coloreada, que tiene un máximo de absorbancia a 595 nm. Las muestras de COS se disolvieron al 1% (p/v) en agua Milli-Q y el reactivo FRAP se preparó mezclando 25 ml de tampón 0,3 M de ácido acético/acetato de sodio pH 3,6, con 2,5 ml de TPTZ 10 mM en HCl 400 mM y con 2,5 ml de cloruro de hierro 20 mM, que se mantuvo a 37°C hasta su uso. A 30 µl de la solución de COS se le añadieron 90 µl de agua Milli-Q y 900 µl del reactivo FRAP. La mezcla se agitó en vórtex y se calentó a 37°C durante media hora. Transcurrido este periodo se realizaron medidas de absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro Specord® 205 (Analytik Jena, Alemania). Como patrón se utilizó una curva de Trolox en agua Milli-Q en un intervalo de concentraciones de 0 a 800 µM y como blanco se utilizó agua Milli-Q.

7.2.5. Método ORAC

Este ensayo que determina capacidad de absorción de radicales de oxígeno, está basado en el método propuesto por Huang et al., (2002) y se llevó a cabo con ligeras modificaciones llevadas a cabo en nuestro laboratorio. Se basa en la capacidad del AAPH (2, 2'- Azobis(2- amidinopropano dihidrocloruro)) para generar radicales peroxilo (ROO·), los cuales van a reaccionar con la fluoresceína (3’,6’-dihidroxifluorano), disminuyendo así su fluorescencia. Para este ensayo se utilizaron microplacas de fluorescencia de 96 pocillos (Microfluor 2, Thermoscientific, España) y un lector de placas Bio-Tek FL 600TM _{(Biotek® Instrument Inc,}

Estados Unidos). Las muestras de COS se disolvieron al 1% (p/v) en agua Milli-Q. El reactivo de fluoresceína se preparó a concentración 8,16 x 10-5 _{mM en tampón fosfato de sodio}

(Na2HPO4/NaH2PO4)75 mM pH 7,4 y por otro lado el reactivo AAPH a concentración 153 mM

en el mismo tampón fosfato. A 150 µl de solución de fluoresceína se le añadieron 25 µl de distintas diluciones de solución de COS y se mantuvo durante 15 minutos en reposo a 37°C. Transcurrido este periodo se añadieron 25 µl de reactivo AAPH, y se inició una cinética de 2 horas en el fluorímetro, equilibrado a 37°C. La fluorescencia se leyó a 485 nm de excitación y a 528 nm de emisión hasta su completa extinción. Estas medidas permitieron calcular el área bajo la curva, la cual incrementa de manera lineal en presencia de agentes antioxidantes en el medio. Como patrón se utilizó una curva de Trolox en tampón Na2HPO4/NaH2PO4 75 mM pH

69 7,4 en un intervalo de concentraciones de 6 a 75 µM y como blanco tampón Na2HPO4/NaH2PO4.