Ensayos in vitro

7.4.3.1. Cultivo de macrófagos Raw 264.7

Se utilizaron macrófagos peritoneales murinos de la línea celular establecida Raw 264.7. Estos se mantuvieron en una atmósfera de 95% aire y 5% CO2 a 37°C en medio de cultivo DMEM-

HEPES suplementado con 10% (v/v) de FBS inactivado por calor, 10 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 250 ng/ml de fungizona y de gentamicina.

7.4.3.2. Ensayo de citotoxicidad

Este ensayo se realiza para cuantificar la viabilidad celular y está basado en método propuesto por Hansen et al., (1989). El MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) es una sal amarilla hidrosoluble que se metaboliza por la enzima succinato-deshidrogenasa de las mitocondrias de células metabólicamente activas, transformándose en formazán, una sal azul insoluble que se acumula dentro de las células. Al lisar las células con DMSO, el formazán también se solubiliza y el medio se torna azul, de diferente intensidad según la cantidad de células vivas que hayan quedado tras finalizar el tratamiento.

Para llevar a cabo este ensayo se plantaron 4x104 _{células por pocillo en DMEM-HEPES 10% FBS,}

en una microplaca de cultivo celular p96 y se incubaron toda la noche en el incubador a 37°C y 5% CO2. Al día siguiente, se retiró el medio de cultivo y se añadió medio nuevo, el cual

contenía LPS (0,3 µg/ml) o COS (0,2; 0,5; 2 y 5 mg/ml) o ambos compuestos, y se incubó la placa durante 5 horas a 37°C, 5% CO2. Transcurrido este tiempo, se retiró nuevamente el

medio de cultivo y se sustituyó por medio nuevo que contenía 5 mg/ml de MTT, y se incubó la placa a 37°C, 5% CO2 durante 4 horas. Finalmente, se retiró el medio y se lisaron las células con

DMSO. A continuación se midió la absorbancia a 570 nm en un lector de placas SinergyTM _HT

(BIOTEK, Reino Unido) y se calculó el porcentaje de viabilidad de las células en cada pocillo con tratamiento refiriéndolo a la viabilidad de las células en los pocillos sin ningún tratamiento. Los ensayos se realizaron por triplicado.

73 7.4.3.3. Estimulación in vitro con LPS y/o COS e inmunodetección de proteínas (Western Blot)

Para llevar a cabo la detección de proteínas implicadas en la señalización temprana del proceso inflamatorio, se realizaron estímulos de 30 minutos con LPS y con cada uno de los COS solos o con LPS. Para ello se plantaron 106 _{células en medio de cultivo DMEM-HEPES 0,1% FBS}

por pocillo en placas de cultivo p6 y se incubaron toda la noche en el incubador a 37°C y 5% CO2. Al día siguiente, el medio existente se suplementó con los diferentes estímulos: 0,3 µg/ml

de LPS, 2 mg/ml de COS, y ambos juntos. Transcurridos los 30 minutos, se aspiró el medio, se lavó una vez con PBS frío y se guardó la placa en un congelador a -80°C con objeto de que todas las células parasen su metabolismo a la vez.

Para preparar el extracto de proteínas, se añadieron 100 µl de tampón de lisis a cada pocillo y se recogieron las células lisadas en tubos eppendorf. Este extracto celular se centrifugó a 4°C durante 20 minutos a 14000 rpm en una centrífuga Mikro 22 R (Hettich Centrifuge, Reino Unido) y se reservó el sobrenadante para llevar a cabo la cuantificación de proteínas totales mediante el método del ácido bincocínico (BCA) utilizando un kit de ensayo de proteínas PierceTM _{BCA (Life Technologies, Estados Unidos). Una vez cuantificados los extractos, se}

prepararon 30 µg de proteína junto con el tampón de carga Laemmli (5/1 v/v) en condiciones desnaturalizantes/reductoras. Se hirvieron 4 minutos a 96°C para la posterior separación de proteínas según su tamaño molecular en geles al 9% de poliacrilamida SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes. Tras la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y estas se bloquearon con 5% de leche semidesnatada en TTBS durante una hora en agitación. A continuación las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes en TTBS con 5% de BSA y 0,025% de azida sódica durante toda la noche a 4°C en agitación. Tras 2 lavados sucesivos de 16 minutos con TTBS, las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con peroxidasa en TTBS con 1% de leche durante una hora a temperatura ambiente en agitación. Tras 3 lavados sucesivos con TTBS más un lavado con TBS de 10 minutos, la presencia de los distintos antígenos se detectó mediante un método quimioluminiscente (ECL). Finalmente las membranas lavadas se incubaron con ECL durante 3 minutos y se

74 revelaron utilizando películas de rayos X. La señal se cuantificó mediante densitometría con el programa informático ImageJ8_.

7.4.3.4. Estimulación precedida de incubación con inhibidores

En los ensayos en los que se usaron estas drogas, la adición de estímulos (LPS y COS) se realizó, tras una pre-incubación de 30 y 45 min con sulfato de polimixina B (1 µg/ml) o citocalasina B (10 µg/ml) respectivamente, en las mismas condiciones descritas en el apartado 7.4.3.3. de este capítulo.

7.4.3.5. Detección de especies reactivas del oxígeno

La detección del nivel de especies reactivas del oxígeno (ROS) intracelular se llevó a cabo mediante el método descrito por Engelmann et al., (2005), basado en la oxidación del sustrato 2’,7’-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA). Este es un fluorocromo hidrofóbico que difunde a través de la membrana celular al citoplasma, donde es desacetilado por esterasas intracelulares a DCFH (2’,7’-diclorofluoresceína), compuesto no fluorescente. El DCFH es oxidado rápidamente por las ROS presentes intracelularmente o que se hayan generado como consecuencia de un daño oxidativo, formándose diclorofluoresceína (DCF), compuesto fluorescente que puede ser excitado a 485 nm, emitiendo señal a 528 nm, cuya intensidad se puede detectar por citometría de flujo.

Se plantaron 4x105 _{células por pocillo en DMEM-HEPES 10% FBS, en una microplaca de cultivos}

p12 y se incubaron durante 6 horas en el incubador a 37°C y 5% CO2. A continuación se añadió

al medio H2O2 (500 µM) como estímulo positivo o 2 mg/ml de COS, y se incubaron durante 18

horas en las mismas condiciones. Transcurrido este periodo, se retiró el medio de cultivo, se añadió tripsina para levantar las células, y tras centrifugar durante 5 minutos a 1200 rpm, las células se pasaron a tubos de citómetro a los que se añadió 10 µM de DCFH-DA disuelto en PBS. Estos se incubaron a 37°C y 5% CO2 durante 30 minutos. En el minuto 25 se añadió ioduro

de propidio 2 µM, para distinguir células vivas de muertas, y las muestras se analizaron con el citómetro de flujo FC 500 MPL (Beckman Coulter, Estados Unidos, Servicio Interdepartamental de Investigación de la Universidad Autónoma de Madrid).

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