Los promotores de los genes Mx se han estudiado en detalle en humanos [137], ratones [138] y varias especies de teleósteos [139]. Los promotores Mx contienen al menos un motivo ISRE. La presencia de los motivos ISRE en los promotores Mx indica su conexión a la vía típica de los IFN, activando la transcripción de los genes inducibles por IFN (ISG). Nosotros contamos con una línea celular (MDBK-t2) que contiene de forma estable el promotor Mx humano río arriba del ORF para la cloranfenicol acetil transferasa (CAT). Este promotor es sensible a los IFN bovinos [121], [122]. De esta forma, la cantidad de CAT cuantificada por ELISA correlaciona con la cantidad de unidades de IFN con el que se estimularon las células [122]. Utilizando un IFN de referencia de actividad conocida
Figura 1.16. Efecto del momento del agregado de los IFN durante el ciclo de infección viral. Monocapas de células MDBK fueron tratadas con IFN-α(A) o IFN-λ3 (B) en distintos momentos del ciclo infectivo, según se indica. La infección se realizó con VDVB cepa Singer (1a, CP) a una moi= 0,5. *Diferencias significativas respecto al control de infección, p<0.05.
79 TABLA 1.3. Concentración de IFN activo determinado por CAT-ELISA. Células MDBK-T2 que contienen integrado al genoma el gen para CAT bajo el promotor Mx fueron tratadas con los sobrenadantes de células HEK293T transfectadas con los vectores que se indican. Las células son lisadas, se determinan proteínas totales y se mide la cantidad de IFN activo en función a la concentración de CAT estimada por ELISA.
(expresada en Unidades/ml) se puede calcular la concentración IFN activo en los sobrenadantes de transfección.
Los resultados obtenidos con esta técnica se muestran en la Tabla 1.3. Se corroboró por este método, la falta de actividad del IFN-λ3 con Poly-His. Los diferentes lotes preparados cuentan con una actividad similar. Este método no solamente permite una cuantificación simple de los IFNr sino que además corrobora su capacidad de activar ISG.
EFECTO DE LOS INTERFERONES RECOMBINANTES SOBRE LA VIABILIDAD
CELULAR
Una vez establecidos los valores de unidades activas de cada lote de los IFN-α y λ3, las preparaciones de cada IFNr fueron agregadas a la monocapa de células MDBK en diluciones seriadas e incubadas durante 24 hs y la viabilidad celular fue evaluada mediante la determinación de la capacidad de las células de reducir XTT que resulta en una reacción colorimétrica, siendo una técnica más sensible que la tinción con cristal violeta.
Se estimó un rango de valores de DO para células no-infectadas y células no tratadas (DO: 0,9-1,2) y para células infectadas con la cepa Singer de VDVB (MOI=1, 48 hs pi) o metabólicamente estresadas y blancos (DO<0,22). Las concentraciones de IFN-λ3 de hasta 45 U/ml no resultaron tóxicas para las MDBK. El rango fue más bajo para el IFN-α, la concentración más alta evaluada arrojó valores de DO que fueron significativamente más bajos que aquellos medidos para las células sin-tratamiento o las células con tratamiento simulado (p<0,05) Figura 1.17.
RESULTADOS – CAPÍTULO 1 80 IFN-α (UI/ml) 40 20 10 5 2,5 1,25 0 0,66 0,86 1,01 1,02 1,14 1,01 0,92 0,78 1,07 0,99 1,06 1,08 1,18 0,88 0,68 1,01 1,01 1,12 1,15 1,18 1,10 PROMEDIO 0,71 0,98 1,00 1,06 1,12 1,12 0,97 Citotoxicidad (%) 36,66 -1,36 -3,78 -9,18 -13,82 -13,82 IFN-(UI/ml) 45 22,5 11,25 5,62 2,81 1,41 0 0,762 0,905 0,914 1,03 1,12 1,09 0,889 0,724 1,079 1,351 1,15 1,2 1,15 1,1 0,896 0,908 0,922 0,989 0,99 1,21 1,2 PROMEDIO 0,79 0,96 1,06 1,06 1,10 1,15 1,06 Citotoxicidad (%) 33,88 0,28 -9,01 -8,49 -12,39 -15,94
Figura 1.17. Efecto de los IFNr sobre la viabilidad celular. Las células fueron tratadas con diluciones seriadas de IFNr y la viabilidad celular fue evaluada mediante la determinación de la capacidad de las células de reducir el XTT. Valores de DO para células no infectadas: 0,9- 1,2 y para células infectadas con VDVB-Singer o metabólicamente estresadas: <0,22 (marcadas en gris). Los resultados están expresados como la media de los valores de DO ± DE. (*) Diferencias significativas comparadas con los valores de DO de las células sin tratar, p<0,05.
TABLA 1.4. Evaluación de la citotoxicidad de los IFNr utilizando la determinación de viabilidad mediante reducción del XTT. Los valores de DO obtenidos por la lectura del cristal violeta solubilizado fueron utilizados para estimar el porcentaje de toxicidad para cada concentración IFN-λ3 ó α, según se indica.
Con estos resultados se procedió a estimar el porcentaje de citotoxicidad, siguiendo la metodología descripta más arriba. La citotoxicidad de los stocks utilizados, aún sin diluir, no alcanza el 50% para ninguno de los IFNr, siendo una dilución al medio totalmente inofensiva y atóxica para las células (Tabla 1.4). Basándonos en este ensayo, se seleccionó una concentración de trabajo para ambos IFNr que no afectara en absoluto la viabilidad de las células MDBK (~20 U/ml). IFN-α IFN-λ Células muertas D O (450n m) IFNr (U/ml)
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RESUMEN
Con el objetivo de desarrollar interferones de tipo I (α) y III (λ) bovinos, se clonaron las secuencias para ambas citoquinas, obtenidas por RT-PCR a partir de ARNm total de células de riñón fetal bovino (cultivo primario) infectadas con el virus de la fiebre aftosa, capaz de inducir la expresión de ambos IFN en este tipo celular. El IFN-α fue elegido ya que es el IFN tipo I mayormente utilizado en terapias contra el VHC. Sin embargo, este IFN suele causar efectos adversos debido a que sus receptores son pleiotrópicos. Con el fin de contar con un segundo producto bioterapéutico nos enfocamos en el IFN-λ3 que tiene la misma actividad biológica que los IFN-I pero que posee receptores en células epiteliales, con especial tropismo por los epitelios de las superficies mucosales.
Se realizaron construcciones independientes conteniendo el ORF para los IFN-α y λ en un plásmido que permite la expresión desde el promotor de CMV, en células de mamífero. Este plásmido incorporaba además, en el extremo carboxilo terminal de la proteína expresada, una secuencia de 6 Histidinas (Poli-HIS) que permiten la detección de la proteína expresada y eventualmente su purificación utilizando columnas de afinidad. Se transfectaron células HEK293T y se obtuvieron los productos de expresión del tamaño esperado que fueron revelados con un anticuerpo comercial anti-HIS. Los IFNr expresados en este sistema se acumulaban en el sobrenadante de las células transfectadas a las 48 hpt.
Se determinó entonces la actividad de los IFNr por dos metodologías: (1) reducción del número de placas de lisis utilizando VSV como virus de referencia y VFA, para el cual la actividad de los INF-α y λ bovinos ha sido descripta en profundidad; y (2) capacidad de los IFNr de activar al promotor Mx utilizando un sistema reportero (células MDBK-T2/CAT). El IFN-α fue activo, no así el IFN-λ. Trabajos anteriores con IFNr de otras especies habían mostrado que, en algunos casos, la presencia de secuencias adicionales como la etiqueta de histidinas “HIS-Tag” podría interferir con la actividad de este IFN. El ORF para INF-λ3 fue entonces sub-clonado en un plásmido equivalente, pero sin dicha secuencia.
La actividad de los IFNr fue determinada por los métodos antedichos, obteniéndose lotes de IFN-α e IFN-λ3 bovinos biológicamente activos con una concentración efectiva 50% de aproximadamente 40 U/ml. Los valores fueron similares a los estimados por reducción del número de placas de VSV. Habiendo comprobado la capacidad de estos sistemas para producir las proteínas recombinantes con la actividad esperada, se procedió a evaluarlos en cuanto a su eficacia contra diferentes cepas del VDVB.
RESULTADOS – CAPÍTULO 2
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