Se realizó el diseño de los cebadores para amplificar el ORF que codifica para el IFN-α (GenBank: NM_001017411.1) y el IFN-λ3 bovino (GenBank: HQ317919.1).
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1 2 3 4 5
Nombre Longitud PM Tm° nmol GC % Secuencia
Fw-λ3 28 8550 84.9 54.9 64.2 CAGAATTCATGGCCCCGGGCTGCACGCT
Rw-λ3 30 9158 74.4 42.0 53.3 TCTAGATTAGACACACTGGTCTCCGCTGGC
Fw-α 29 8857 90.3 47.3 75.8 CCGCTCGAGATGGCCCCGGGCTGCACGCT
Rw-α 30 9096 86.1 67.8 70 TCTAGAGACCAGGTGTGTGTCAGTCC
Se extrajo ARN total de células de Riñón Fetal Bovino (RFB) infectadas con VFA cepa A24 Cruzeiro (MOI=0.2) utilizando Trizol, según se detalla en “Materiales y métodos”. La concentración del ARN extraído se determinó utilizando un Nanodrop (NanoDrop2000®
spectrophotometer, Thermo Scientific). Con los cebadores diseñados, se realizó una retro- transcripción para obtener los ADNc correspondientes a cada ORF. Para el caso de IFN- λ3, en un primer intento se obtuvo ADNc inespecífico debido a la temperatura de anillado de la RT-PCR, la cual fue modificada de 55 a 60ºC. Una vez establecida la temperatura correcta se realizó la amplificación de ambas secuencias (Figura 1.1).
Al haber resultado algo laborioso este primer paso de RT-PCR particularmente para el IFN- λ3 (por la variante en su temperatura de anillado), antes de enviar la muestra a secuenciar decidimos primero corroborar la identidad del fragmento correspondiente al IFN-λ3 realizando una digestión enzimática del producto de PCR con NcoI (Figura. 1.2 A) y se obtuvieron fragmentos esperados de aproximadamente 266 y 326pb. Una vez corroborada la digestión enzimática se enviaron a secuenciar los amplicones de PCR para confirmar su identidad tanto para IFN-λ3 como para α (Figura 1.2 B y 1.3). La digestión enzimática no se realizó con el producto de IFN-α.
Figura 1.1. Gel de Agarosa 1,8% de los productos de la RT-PCR. Se observan dos bandas, una de ~588 pb que corresponde al ORF del IFN-λ3 y otra de ~662 pb, que corresponde a IFN-α según se indica. Se corrieron también los controles negativos de la PCR (utilizando el agua de dilución en lugar del ADNc). Calle 1: Ladder 100pb (Biodynamics SRL); 2: IFN-λ3, 3: IFN-α; 4 y 5: control negativo.
Tabla 1.1. Cebadores utilizados para amplificar las secuencias codificantes de los IFN- α y λ3 bovinos. Se indica en negrita los sitios para las enzimas de restricción elegidas para realizar el clonado.
RESULTADOS – CAPÍTULO 1
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1 2 3
A B
Las bandas correspondientes a IFN-α e IFN-λ fueron luego cortadas de un gel de agarosa preparativo, purificadas utilizando un kit comercial (Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System, GE) y luego clonadas en pGEM-T (Promega). Los plásmidos obtenidos fueron digeridos con diferentes enzimas de restricción, según se tratara de IFN-α o λ, para seleccionar los clones positivos que incorporaron el fragmento correspondiente. Se utilizó EcoRI y XhoI-XbaI para IFN-α; y se utilizó NcoI que corta en la secuencia del IFN-λ (ver más arriba). Estas muestras fueron corridas en geles de agarosa al 0,8% m/v. (Figura 1.4 A, B).
Figura 1.2. Evaluación del amplicón correspondiente al ORF para IFN- bovino. (A) Gel de Agarosa al 1,8% donde se muestra del producto digestión del amplicón para IFN- sin digerir y digerido con NcoI, según se indica. Se observan los productos de la digestión, dos fragmentos de ~ 266 y 326 pb. Calle 1: Ladder 100pb (Biodynamics SRL); 2: IFN-λ digerido con enzima de restricción NcoI; 3: IFN-λ sin digerir. (B) Resultado del análisis de la secuencia del amplicón y su identitdad por homología en GeneBank .
Figura 1.3. Evaluación del amplicón correspondiente al ORF para IFN-α bovino. Se realizó un BLAST con la secuencia obtenida a partir del análisis del producto de RT-PCR para IFN-α bovino y se obtuvo un fragmento con un 93% de homología con la secuencia de referencia.
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1 10 12 1 8
A B
500 pb
500 pb
Las secuencias clonadas en pGEM-T fueron subclonadas en el vector pcDNA4-HisMaxA (Invitrogen®). En este vector, los ORFs quedan bajo el promotor de CMV que permite
expresar proteínas en células de mamíferos utilizando la ARNPol2. Por otro lado, el vector incorpora una secuencia codificante para 6 residuos de histidina “Poli-His” que permite la identificación y purificación de las proteínas. De esta manera, una vez seleccionados los plásmidos que incorporaron correctamente los fragmentos correspondientes a IFN-α o λ3 los mismos fueron digeridos con las enzimas de resticción: XhoI-XbaI para IFN-α y EcoRI- XbaI para IFN-λ3. Los productos de digestión fueron corridos en un gel preparativo (0,8% m/v). Las secciones (bandas) correspondientes a los IFNs fueron extraídas de los geles e incorporados en el vector pcDNA-HisMaxA pre-digerido con las mismas enzimas según el producto a clonar. Los constructos se verificaron mediante electroforesis en un gel de agarosa 1,7% m/v donde volvieron a seleccionarse los clones positivos que incorporaron los fragmentos de IFN-α o λ3. (Figura 1.5 A y B).
A B
MWM
Eco-R1 Xho-I/Xba-I Nco-I
MWM
Figura 1.4. Búsqueda de colonias positivas (screening). Clonado de los amplicones correspondientes para los ORF de IFN-α (A) e IFN-λ3 (B) en pGEM-T easy vector. Los plásmidos purificados de las bacterias resistentes a penicilina (agente de selección) fueron digeridos con las enzimas que se indican. Se indican fragmentos del tamaño esperado y los clones positivos encontrados. MWM: marcador de eso molecular “100bp Ladder (Biodynacics SRL)”.
Figura 1.5. Verificación de constructos que incorporaron IFN-α e IFN-λ: (screening). Clonado de los amplicones correspondientes para los ORF de IFN-α (A) e IFNλ3 (B) en pCDNA4HisMaxA. Los plásmidos purificados de las bacterias resistentes a penicilina (agente de selección) fueron digeridos con las enzimas: XhoI-XbaI para IFN-α y EcoRI-XbaI para IFN-λ. (A) Calle 1: Ladder 100pb (Biodynamics SRL); 10: indicado con flecha clon positivo, plásmido digerido con XhoI-XbaI que libera inserto de ~662 pb; 12: plásmido sin digerir. (B) Calle 1: Ladder 100 pb (Biodynamics SRL); 8: indicado con flecha el único clon negativo que no libera el fragmento. El resto libera inserto de ~588 pb.
RESULTADOS – CAPÍTULO 1
70 Las construcciones fueron secuenciadas nuevamente. No se encontraron mutaciones ni deleciones. (Figura 1.6 y 1.7).
Figura 1.6. Verificación de la secuencia correspondiente a IFN-α clonada en pcDNA4HisMaxA. El fragmento liberado por el clon seleccionado positivamente a partir de la digestión del plásmido con las enzimas de restricción XhoI-XbaI fue secuenciado y analizado. En la figura se muestra el BLAST donde se observa un 94% de identidad con la secuencia de referencia publicada en el Gene Bank.
Figura 1.7. Verificación de la secuencia correspondiente a IFN-λ3 clonada en pcDNA4HisMaxA. El fragmento liberado por el clon seleccionado positivamente a partir de la digestión del plásmido con las enzimas de restricción EcoRI-XbaI fue secuenciado y analizado. En la figura se muestra el BLAST donde se observa un 99% de identidad con la secuencia de referencia publicada en el Gene Bank.
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