Actividad farmacológica

Las chalconas son precursoras de los flavonoides e isoflavonoides, moléculas que contienen en su estructura química un número variable de grupos hidroxilo, lo cual les confiere una gran capacidad antioxidante y excelentes propiedades de quelación del hierro y otros metales de transición. La notable diversidad estructural y funcional de los flavonoides ha

Capítulo 2

Antecedentes

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proporcionado las bases para la investigación en áreas que van desde la genética y la bioquímica a la salud humana. Además tienen efectos terapeúticos en un elevado número de patologías166-168.

Las chalconas, a su vez, pueden ser consideradas como estructuras privilegiadas ya que se ha descrito que poseen múltiples aplicaciones terapéuticas. Presentan un amplio espectro de actividad biológica como por ejemplo actividad antitumoral166,169-172, antiinflamatoria173-175, antibacteriana167,176,177, antifúngica178, analgésica179 y antioxidante168,180. Algunos ejemplos representativos de chalconas bioactivas quedan reflejados en la Tabla 14.

Antecedentes

Capítulo 2

125 Tabla 14. Ejemplos representativos de chalconas con diferentes actividades

farmacológicas

Estructura Actividad Farmacológica Antiproliferativo181 Antiproliferativo182 Antiinflamatorio183 Antileishmania184 Antimicrobiano185 Antifúngico186 Antinociceptivo187

Además, las chalconas pueden actuar como moduladores de canales iónicos. Existen algunos ejemplos descritos en la bibliografía de chalconas que actúan como bloqueantes de canales de K+ voltaje-dependientes, como la sulfonato-chalcona 2.6188, que inhibe la corriente de K+ alcanzando el máximo de inhibición después de 5 min. Este compuesto presentó interés para el

Capítulo 2

Antecedentes

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tratamiento de la desmielinización post-traumática de los axones de la medula espinal, contribuyendo a mejorar el impulso en neuronas desmielinizadas. También se describió la activación por sulfonato chalconas de canales TREK2, un canal de dos poros que presenta cuatro dominios transmembrana y que constituye una de las cuatro familias de los canales de K+. La activación de dichos canales presenta interés en dolor neuropático, neuroprotección y secreción de insulina189.

Por otra parte, existen chalconas descritas como bloqueantes de canales de Ca2+, destacando el compuesto 2.7, que inhibe la contracción tónica producida por norepinefrina y fenilefrina190. Este efecto indica que dicho compuesto se comporta como bloqueante de los canales de Ca2+.

Figura 39. Derivados de chalcona con actividad moduladora de canales iónicos. En nuestro conocimiento, hasta el momento no se han descrito en la bibliografía chalconas capaces de actuar como moduladores de canales nicotínicos.

Objetivos

Capítulo 2

129 En base a los antecedentes comentados, el objetivo de este capítulo se centra en la búsqueda de nuevas chalconas o compuestos análogos, que tengan actividad como moduladores alostéricos del canal nicotínico α7. Se pretende mejorar la potencia y selectividad del prototipo referido previamente, 97, e identificar nuevos análogos con mejor perfil farmacológico. Para ello, se propone la preparación de una colección de derivados de dicho compuesto 97, llevando a cabo diferentes modificaciones:

 Variar el número y posición de los grupos OH, tanto en el anillo aromático A como en el anillo aromático B.

 Introducir en el anillo aromático B sustituyentes diferentes al grupo hidroxilo, así como sustituir este anillo por un sistema de indol.

 Modificar el sistema carbonílico α,β insaturado del espaciador.

 Realizar modificaciones que conlleven una mayor restricción conformacional.

Los compuestos de esta colección serán evaluados para medir su capacidad de modulación de la actividad inducida por acetilcolina en canales nicotínicos 7, lo que nos debería permitir establecer relaciones estructura- actividad. Los mejores compuestos serán sometidos a caracterización farmacológica adicional.

Capítulo 2

Objetivos

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Figura 40. Representación gráfica de los objetivos

Modificaciones en el Anillo A

HIT

Modificaciones en el Anillo B

RELACIONES ESTRUCTURA-ACTIVIDAD (SAR) Modificaciones en el

Espaciador

EVALUACIÓN 7 nAChR

Resultados y Discusión

Capítulo 2

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2.4.1 Síntesis de Chalconas polihidroxiladas

De acuerdo con los objetivos propuestos, en primer lugar, nos planteamos la preparación de una serie de chalconas polihidroxiladas con el fin de determinar el número de grupos hidroxilo que dan lugar a los mejores resultados de actividad biológica, así como las posiciones óptimas de sustitución en los anillos aromáticos. En general, se ha mantenido la sustitución en posiciones 2’ y 5’ del anillo A, dado que los mejores resultados del cribado de la colección de chalconas comerciales se obtuvieron con los grupos OH situados en estas posiciones. La síntesis de las chalconas (1,3- diaril-2-propen-1-onas) objeto de estudio, se realizó en dos etapas (Esquema 3). En primer lugar se sintetizaron los derivados metoxilados 2.16-2.22 siguiendo la reacción de condensación de Claisen-Schmidt, a partir del correspondiente benzaldehído con la acetofenona apropiada, bajo condiciones de catálisis básica (NaOH, 40%) en EtOH. Una vez aisladas las metoxi chalconas, en una segunda etapa se llevó a cabo la desprotección de los grupos metoxilo utilizando BBr3 (1M) en DCM bajo atmósfera inerte191,

Capítulo 2

Resultados y Discusión

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Esquema 3

Los derivados metoxilados 2.16-2.22 se purificaron mediante cristalización de MeOH, obteniéndose con alta pureza y buenos rendimientos en general. Estos compuestos han sido caracterizados mediante técnicas de HPLC, EM, y RMN. En los espectros de 1H-RMN se observan las señales correspondientes a los protones del doble enlace del sistema carbonílico α, β- insaturado en el entorno de 7.5-8.0 ppm con una constante de acoplamiento de 15.6-16.0 Hz, lo que indica que el doble enlace generado presenta configuración E (trans).

Una vez preparados los derivados metoxilados se procedió a la desprotección de los grupos metoxilo por tratamiento con BBr3. Según

describen McOmie y col.191, la cantidad de equivalentes de BBr3 necesaria

para completar la reacción de desprotección depende del número de grupos metoxilo a desproteger, utilizándose un equivalente por cada grupo metoxilo.

Resultados y Discusión

Capítulo 2

135 Además los autores recomiendan el uso de un equivalente adicional por cada nitrógeno potencialmente básico y por cada oxígeno presente en la molécula. Sin embargo, en nuestro caso al utilizar la cantidad recomendada de BBr3, se

aislaron productos parcialmente desprotegidos. Así, la desprotección del compuesto 2.16 con 5 equivalentes de BBr3 dio lugar tanto al compuesto

esperado 2.23, como al producto 2.24, en el que únicamente había tenido lugar la desprotección de los grupos metoxilo del anillo A. La posición de los grupos metoxilo en este último compuesto se determinó mediante experimentos de RMN heteronucleares de correlación C-H a dos o tres enlaces (HMBC). Así, se observó correlación entre los protones del OMe en posición 2 del anillo B con el C (δ: 109.58 ppm) y del OMe en posición 4,

también del anillo B, con el carbono de la posición 6 (δ: 130.66 ppm), que confirmaron que ambos grupos metoxilo se encontraban en el anillo aromático B.

En el caso de la desmetilación de 2.19 se aislaron los compuestos 2.28- 2.30, todos ellos parcialmente desprotegidos en el anillo B de la chalcona, mientras que el compuesto totalmente hidroxilado no se consiguió aislar. En base a estos resultados, para obviar la formación de compuestos parcialmente desprotegidos, se decidió utilizar 2 equivalentes de BBr3 por

cada grupo metoxilo a desproteger y otros 2 equivalentes por cada nitrógeno y oxígeno presentes en la molécula, obteniéndose los compuestos 2.25-2.27 satisfactoriamente, aunque con rendimientos de moderados a bajos.

Los productos hidroxilados finales se purificaron por cromatografía flash en fase reversa usando mezclas de acetonitrilo y agua como eluyente. El bajo rendimiento con el que se obtienen los productos se podría explicar por la baja solubilidad de estos compuestos en el proceso de siembra, lo que dificultó su purificación. Además, los intentos de purificación mediante

Capítulo 2

Resultados y Discusión

136

cristalización fueron infructuosos debido a la inestabilidad de estos compuestos polihidroxilados al calentar.

La confirmación de la estructura y posición de los grupos metoxilo en los compuestos 2.28-2.30 se realizó de nuevo mediante experimentos de RMN heteronucleares de correlación C-H a dos o tres enlaces (HMBC).

La obtención de los derivados hidroxilados mono sustituídos en el anillo A, a partir del 2,4-dimetoxibenzaldehído 2.9 y las acetofenonas 2.12 y 2.13 respectivamente, siguiendo el procedimiento habitual, dio lugar a los compuestos 2.21 y 2.22, siendo imposible la desprotección de éstos por tratamiento con BBr3, por lo que se recurrió a una ruta alternativa. En primer

lugar, se intentó la condensación de los productos desprotegidos 2,4- dihidroxibenzaldehído y la correspondiente monohidroxiacetofenona, bajo las condiciones habituales con NaOH (40%) en EtOH. Sin embargo, no se llegaron a formar los compuestos deseados, por lo que se llevó a cabo un estudio de diferentes condiciones de reacción. En primer lugar se empleó Ba(OH)2·8H2O como base192, sin embargo, tampoco se obtuvieron los

derivados polihidroxilados buscados. Por otra parte, también se realizó sin éxito la condensación usando como alternativa catálisis ácida, con ácidos de Lewis como por ejemplo Yb(OTf)3 y AlCl3193. Finalmente el uso de BF3·Et2O

en las condiciones descritas por Narender y col.194 permitió la obtención de los derivados m- y p-hidroxilados 2.35 y 2.36. Sin embargo, el derivado o- hidroxilado tampoco pudo obtenerse por este procedimiento, recuperándose en este caso los productos de partida inalterados, 2.31 y 2.32 (Esquema 4).

Resultados y Discusión

Capítulo 2

137 Esquema 4

Estos compuestos fueron caracterizados mediante las técnicas habituales. Es de destacar que en estas condiciones de reacción se obtuvieron los isómeros Z, un resultado diferente al obtenido bajo condiciones de catálisis básica, en las que siempre se había observado la formación de los isómeros E. Así, en los espectros de 1H-RMN de Z-2.35 y Z-2.36 aparecen las señales correspondientes a los protones del doble enlace en el entorno de 7.5-8.0 ppm con una constante de acoplamiento de 8.8 Hz.

A la vista de estos resultados, y con el fin de obtener el isómero E de estos compuestos, se siguió el método descrito por Kim y col195, que consistía en llevar a cabo la protección de los grupos hidroxilo con metil clorometil éter (MOMCl) antes de proceder a la condensación (dada la baja reactividad de los aldehídos con hidroxilos libres en la condensación aldólica en medio básico). Así, en primer lugar, se preparó el aldehído MOM protegido 2.37 y a continuación se realizó su condensación con la correspondiente acetofenona monohidroxilada en las condiciones habituales, seguido de una segunda etapa de desprotección del grupo MOM por tratamiento con HCl (10%). Este procedimiento permitió la obtención de los compuestos deseados E-2.35, E- 2.36 y E-2.38, aunque el rendimiento global de las dos etapas fue bajo. En el caso del o-hidroxi derivado E-2.38, se formó además el subproducto 2.39, aislado también del medio de reacción. La formación de flavanonas en medio

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Resultados y Discusión

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ácido es muy común a partir de chalconas orto-hidroxi sustituidas en el anillo aromático A, como se ha descrito por Mai y col.196.

Esquema 5

En los espectros de 1H-RMN de los derivados E-2.35, E-2.36 y E-2.38 se observan las señales correspondientes a los protones del doble enlace del sistema carbonílico α,β-insaturado, en el entorno de 7.5-8.0 ppm con una constante de acoplamiento de 15.4-15.9 Hz, lo que demuestra que los compuestos formados por este método se corresponden a los isómeros E. En el espectro de 1H-RMN del compuesto 2.39 se pudo observar la aparición de un sistema ABX, correspondiente a los protones alifáticos del nuevo anillo formado y la desaparición de los protones correspondientes al doble enlace.

Durante un estudio de solubilidad en tampón PBS a pH 7.4 con el compuesto E-2.23 se constató que con el tiempo este compuesto se transformaba parcialmente en su correspondiente isómero Cis Z-2.23 (proporción aproximada del 40% en 7 días). Esta conversión puede deberse a la fotoisomerización de la chalcona E por la luz, tal y como se ha descrito en la bibliografía, donde se indica que la isomerización E/Z puede ser reversible, dependiente del pH y de la luz UV197. Este tipo de transformación también ha

Resultados y Discusión

Capítulo 2

139 podido correlacionarse con los sustituyentes existentes en los anillos A y B de la molécula198 (Esquema 6). La isomerización se repitió a escala preparativa para disponer de cantidad de Z-2.23 y poder evaluar la influencia de la estereoquímica del doble enlace en la actividad moduladora de 7.

Figura 41. A) Cromatograma de la mezcla de isómeros E-2.23 y Z-2.23 (25 ºC, 7

días).

2.4.2 Modificaciones en el anillo aromático B