Activitat enzimàtica ornitina decarboxilasa

FONAMENT

L’ornitina decarboxilasa (ODC; [EC 4.1.1.17]) és un enzim intracel.lular que catalitza de forma preferent la formació de putrescina a partir de L-ornitina (Pegg i Williams-Ashman 1968). Pot actuar també sobre la L-lisina formant cadaverina i CO2 però la Km d’aquesta reacció és 100

vegades més gran que per l’ornitina (Pegg i McGill 1979). Els mètodes existents per determinar l’activitat ODC depenen de la quantificació d’un dels dos productes de la reacció. La gran majoria de les dades experimentals d’activitat ODC que es poden trobar a la bibliografia s’han obtingut amb mètodes que utilitzen [1-14_{C]-ornitina i impliquen la captura del} 14_CO

2 alliberat (Figura

2.33).

Figura 2.33 Decarboxilació del substrat marcat en l’assaig d’activitat ODC.

Aquest principi va ser aplicat per primera vegada per determinar l’activitat biosintètica ODC en procariotes per Morris i Pardee (1965) i modificat posteriorment per l’assaig de l’ODC eucariota (Siimes i Jänne 1967, Russell i Snyder 1968). La reacció entre el substrat radioactiu i l’enzim de la mostra es duu a terme en un tub de vidre tancat hermèticament amb un tap de goma i s’atura per injecció d’una solució d’un àcid fort que serveix, a la vegada, per desplaçar l’equilibri:

H1 4_CO 3- + H3O+ = H21 4CO3 + H2O → 1 4C O2↑ 1 4_C NH3 NH3 O HO ornitina H3N NH3 putrescina + 14C HO O OH + H O H ODC

totalment a la dreta i per evaporar el 14_CO

2 produït a la barreja de reacció durant una incubació

subsegüent de 30 min. El 14_CO

2 desprès es captura en un petit reservori intern suspès sobre la

barreja de reacció amb una agulla clavada a la part interna del tap. El reservori conté una solució bàsica (NaOH o un altre substància compatible amb el líquid de centelleig) que atrapa de forma estable el diòxid de carboni.

ASSAIG

En els nostres experiments vam aplicar bàsicament les condicions descrites per Russell i Snyder (1968). El tampó inicialment utilitzat de fosfat de sodi i potassi 10 mM va ser substituit per tampó Tris-HCl 100mM en comprovar que es produia una inhibició d’un 20% en l’activitat enzimàtica de les mateixes mostres dissoltes en el primer tampó respecte al segon tampó (Garewall et al. 1992). Breument, mostres de cultius cel.lulars, mucosa intestinal humana o proteïna recombinant d’E. Coli s’homogeneïtzaven en tampó de lisi (0,1M Tris-HCl, 1mM EDTA, 2,5mM DTT, 2mM PLP, 1% Triton X-100 i 5 mg/L fluorur de fenilmetilsulfonil pH = 7,5) a raó de: cultiu en flascó de 75 cm2_{/200 µL, 50 mg teixit/350 µL i cultiu o/n 2 mL/200 µL,}

respectivament. Els homogeneïtzats es centrifugaven a 50.000 × g, 20 min a 4ºC, i la concentració de proteïna soluble total es determinava en els sobrenedants. L’assaig enzimàtic es realitzava amb una quantitat mínima de proteïna total de 1 mg per cultius cel.lulars, 2-10 mg per mucosa intestinal i 2 µg per proteïna recombinant. Les mostres s’afegien al tub a 4ºC, s’afegia la solució de substrat (14_{C-ornitina/ornitina-2HCl) i els tubs es tapaven amb un tap de goma amb un}

reservori contenint 100 µL de solució comercial NCS suspès sobre la reacció. Els tubs s’incubaven en un bany d’agua a 37ºC amb agitació durant 1 h. Després d’aquest temps, la reacció s’aturava de forma simultània en tots els tubs dispositant la gradeta en un bany d’aigua amb gel. S’injectaven 500 µL d’àcid tricloroacètic 5% amb una xeringa d’insulina de 1 mL a través del tap de goma. Una última incubació a 37ºC, 30 min aturada posteriorment en aigua amb gel, precedia la mesura de la radioactivitat. Els reservoris amb NCS es recollien cuidadosament, es submergien en tubs de centelleig amb 5 mL de líquid de centelleig i s’agitaven. El recompte de la radioactivitat es feia a les 2 h i es repetia a les 24 h de l’assaig.

Per les feines de validació de l’assaig vam utilitzar proteïna ODC purificada d’E.coli (Sigma) en la comprovació de la linealitat de l’assaig, com a control positiu i en experiments d’addició estàndar, i l’inhibidor DFMO per detectar la posible formació de 14_CO

2 per reaccions independents de

l’ODC en les cèl.lules i mostres intestinals. Vam comprovar la linealitat de la reacció enzimàtica entre 30 i 90 min en mostres i en proteïna purificada, i la proporcionalitat del senyal radioactiu en funció de la quantitat de proteïna en l’assaig (Figura 2.34).

Figura 2.34 Linealitat de l’asssaig ODC en funció de la quantitat de proteïna ODC E.coli purificada present en l’assaig.

L’activitat catalítica de l’ODC s’expressa com a producte format per unitat de temps. La unitat més utilitzada ha estat el nanomol o picomol (depenent del teixit o del tipus de cèl.lules) de CO2

format en 60 minuts. Són testimonials els laboratoris que segueixen les recomanacions de la IUPAC i expressen l’activitat ODC en katals de CO2. La concentració de l’enzim expressada en

termes d’activitat per massa d’especimen també ha assolit un consens general i es fa majoritàriament per miligram de proteïna soluble encara que hi ha un nombre important de treballs que donen activitats per miligram de teixit. L’aspecte que porta més imprecisió a l’hora de poder comparar valors absoluts d’activitat ODC publicats per diferents laboratoris són les petites modificacions metodològiques o els canvis en els paràmetres experimentals de l’assaig com per exemple el tipus de tampó, el pH, la força iònica, la puresa del substrat, la temperatura, la concentració dels activadors i agents estabilitzants de la reacció, el tipus de líquid de centelleig. Aquests paràmetres condicionen la velocitat de la reacció enzimàtica i, encara que molt sovint s’especifiquen convenientment en els treballs publicats, es desconeix la importància dels canvis que involucren en el valor de les unitats d’activitat ODC. El càlcul de l’activitat, en el nostre cas, es feia de la manera següent:

(a) Càlcul del 14_CO

2 generat en 1 hora a partir del recompte d’U Dpm: U/(2.22×109 Dpm)= V mCi

i de l’activitat específica de la solució de substrat:

V mCi×(1mmol/2 mCi)= W mmol 14CO2

(b) Activitat ODC considerant la proteïna soluble total en l’assaig: (W×106)/P=[nmol CO2/h·mg proteïna]

(1 unitat ODC = quantitat d’enzim que genera 1 nmol 14_CO