Derivatització

2.2.1.2.1 Fonament

La reacció entre les PA i el QCHS té lloc de forma instantània a temperatura ambient. A cadascun dels grups amino primaris i secundaris de la PA s’incorpora una molècula de quinolinilaminocarbonil (QAC) que queda unida per un enllaç de tipus urea. Els compostos resultants tenen les següents estructures:

Figura 2.10 N1,N4–Bis(6-quinolilaminocarbonil)putrescina. Figura 2.11 N1,N4,N8–Tris(6-quinolilaminocarbonil)espermidina. Figura 2.12 N1,N4,N9,N12-Tetrakis(6-quinolilaminocarbonil) N N O H₂ N N N O N H₂ N N O H₂ N NH N N O NH₂ N N O NH N N O NH₂ N N O NH N N O H₂ N N N O

El reactiu QCHS es comercialitza com un sòlid liofilitzat altament higroscòpic. Per dilució en 1 mL d’acetonitril de grau fluorimètric obteniem una solució de treball 10 mM. Un cop dissolt el producte es mantenia en atmosfera d’argó, ja que en poques hores s’hidrolitzava i esdevenia inservible. L’atmosfera inert no evitava completament la degradació del producte, i com es volia optimitzar un mètode de caràcter quantitatiu, es va decidir treballar amb reactiu de nova preparació en tots els casos. D’aquesta forma, en menys de 30 min es consumia una unitat d’AQC (nom comercial del QCHS) per derivatitzar 50 mostres. La cinètica de la reacció, i l’estabilitat dels derivats formats permetien procedir al seu anàlisi cromatogràfic de forma immediata.

2.2.1.2.2 Optimització de les condicions de derivatització

Els estudis realitzats per Cohen i Michaud (1993), i Merali i Clarkson (1996)sobre la reacció del QCHS amb aminoàcids indicaven la necessitat de disposar d’una relació QCHS: grups amino reactius de 4:1 per a obtenir un rendiment màxim. Aquesta relació es vàlida només en condicions òptimes ja que la presència de molècules susceptibles de reaccionar amb el QCHS a les mostres biològiques fa necessari augmentar-la de forma dramàtica. En aquest sentit, no hi ha problema, i sempre segons Cohen, les propietats fluorescents dels productes de la hidròlisi del reactiu permeten arribar a una relació 10.000:1 sense cap interferència en la quantificació. Per altra banda, Weiss et al. (1997) feien servir una relació 400:1 en el seus estudis d’aplicació del mètode a la detecció de PA.

Els tractaments de mostra aplicats a mostres de eritròcit i cèl.lules només deixaven com a potencials interferents de la reacció entre el QCHS i les PA els aminoàcids lliures, les amines i els pèptids. Les concentracions dels primers podien arribar a desenes de micromols per litre a la mostra tractada. Per això, es va determinar com afectava l’addició d’una solució estàndar de 16 aminoàcids 80 µM en la determinació quantitativa de les tres PA. Les concentracions de PA estudiades van ser 5 µM. Dues sèries de cinc derivatitzacions es van cromatografiar en dos experiments diferents amb un grup control de derivatitzacions en absència d’aminoàcids.

Taula 2.8 Paràmetre de quantificació cromatogràfic de les poliamines en absència i en presència d’una barreja d’aminoàcids 80µM Apic/Ae. i. × 102 (n=10) Controls Aminoàcids Putrescina 42,71 ± 3,46 39,46 ± 4,01 Espermidina 15,27 ± 0,29 14,88 ± 1,42 Espermina 15,36 ± 0,72 16,56 ± 1,24

No es van trobar diferències estadísticament significatives en la quantificació dels pics en presència d’aminoàcids respecte als valors trobats en el grup control. En aquest últim, només eren presents les PA i l’estàndard intern, i la relació QCHS:grups amino va ser aproximadament 360:1. En canvi, en presència dels aminoàcids aquesta relació va disminuir

del mètode i per la derivatització de mostres: per un volum de mostra de 10 µL, es van fer servir 20 µL de QCHS 10 mM. Per equilibrar el pH de la barreja de reacció es va utilitzar un tampó de tetraborat sòdic 0,2 M de pH 8,8.

La proporció de volums reactiu:tampó borat recomanada en el cas de treballar amb aminoàcids és igual o inferior a 4:1 (Cohen i Michaud 1993). Com era previsible utilitzar quantitats de tampó més altes per neutralitzar tractaments de mostra àcids, es va investigar l’efecte d’afegir una relació tampó:reactiu de 5,5:1 i 8:1 front a una relació inferior a 4:1 a una mateixa mostra de cèl.lules Caco-2.

Taula 2.9 Paràmetre de quantificació cromatogràfic de les poliamines en funció de la relació volumètrica tampó borat vs. reactiu. Apic/Ae. i. × 102 (n = 3) Vtampó :Vreactiu 3,25 : 1 5,5 : 1 8 : 1 Putrescina 6,27 ± 1,13 5,96 ± 0,01 6,04 ± 0,62 Espermidina 15,70 ± 1,29 15,27 ± 0,77 16,30 ± 0,76 Espermina 17,91 ± 0,81 13,08 ± 0,20* 13,58 ± 0,45*

* Diferències significatives amb p < 0,05

Mentre que les mesures de putrescina i espermidina no es veien alterades per la presència creixent de borat, en el cas de l’espermidina es va observar un descens estadísticament significatiu en la formació de derivat. La relació 3,25:1 es va fer servir en tots els experiments següents. L’esquema de derivatització va quedar establert tal i com es veu a la Figura 2.13. Aquest esquema permetia fer triplicats per a cada mostra derivatitzada, considerant una grandària de bucle d’injecció de 30 µL de capacitat. En optimitzar el mètode d’injecció de mostres cada punxada va requerir una alíquota de 80 µL. Per això, el volum final de la barreja es va augmentar mantenint les proporcions esmentades.

10 µL de mostra tractada o solució d’estàndards

+

5 µL d’estàndard intern 5 µM +

65 µL de tampó de tetraborat sòdic 0,2 M de pH 8,8

↓

20 µL de QCHS 10 mM

2.2.1.2.3 Proves d’estabilitat dels derivats QAC

L’estabilitat dels derivats formats pel QCHS va ser un motiu clau per escollir aquest reactiu. L’absència d’un sistema automàtic d’injecció de mostra en el cromatògraf implicava treballar de forma discontínua i, per això, era necessària una reproduïbilitat molt acurada. Deixant de banda els errors introduïts per operacions tècniques (tractament de mostra, derivatització, injecció de mostra) o les limitacions del sistema, la reproduïbilitat es veia afectada bàsicament per la pèrdua de senyal fluorescent de les mostres.

Es van trobar dos estudis d’estabilitat dels derivats QAC-PA en la bibliografia. Merali i Clarkson (1996), per comprovar l’estabilitat d’aquests productes, van cromatografiar mostres conservades a temperatura ambient durant els tres dies posteriors a la derivatització, i obtenien àrees de pic iguals o superiors al 95 ± 2 % de l’àrea obtinguda de forma immediata a la reacció. Al segon estudi (Weiss et al. 1997), es cromatografiava una solució d’estàndars derivatitzats i conservats a temperatura ambient fent deu punxades durant 1 mes. El coeficient de variació en les mesures quantitatives arribava, en el pitjor dels casos, a 7,5%. Cap dels dos estudis donava explicacions més detallades sobre les proves realitzades.

Les condicions cromatogràfiques establertes a l’inici del procés d’estandarització ens permetien fer un cromatograma cada 50 min. Un treball de 8 hores diàries permetia analitzar 60 alíquotes de mostra injectades setmanalment, si no es tenia en compte una primera punxada diària d’acondicionament del sistema. Es va estudiar llavors quina reproduïbilitat presentaven les mesures de diferents solucions d’estàndards de les tres PA, i l’estàndard intern durant un període d’un mes. Les mostres es van conservar a 4ºC. Alíquotes de cada mostra (n = 10) es van cromatografiar per quadruplicat un cop per setmana.

Taula 2.10 Reproduïbilitat en la quantificació de 10 solucions d’estàndards analitzades durant un mes CV% Putrescina 9,97 Espermidina 8,16 Espermina 9,82 Estàndard intern 6,10

A la Taula 2.10 podeu veure els coeficients de variació totals en la quantificació de cada poliamina durant un mes. Els resultats obtinguts, malgrat ser molt bons, no eren vàlids per estandarditzar el mètode. Es va repetir l’experiment reduint el període d’estudi a dues setmanes, temps més que suficient pels nostres propòsits (Taula 2.11).

Taula 2.11 Reproduïbilitat en la quantificació de 5 solucions d’estàndards analitzades durant 2 setmanes

CV% Putrescina 5,20