Acumulación de datos

Para la elaboración de un modelo predictivo seguro se requiere una gran cantidad de datos, que se deben recoger a lo largo de la totalidad de la curva de crecimiento, por lo que se pueden emplear varios meses de trabajo para llevar a cabo experimentos con múltiples variables de crecimiento. Desde un punto de vista estadístico, los parámetros cinéticos de crecimiento (fase de adaptación, tasa de crecimiento, nivel máximo de población) se obtienen con una buena precisión cuando se replican un número suficiente de veces las curvas de crecimiento y cuando cada réplica contiene un gran número de puntos experimentales que la describen (Begot y col., 1996).

Los métodos de acumulación de datos son variados, pero el método estándar es el recuento en placa, ampliamente utilizado desde los comienzos de la microbiología. Este método es el preferido para la enumeración de células, a pesar de la posible subestimación por la presencia de agregados de microorganismos en forma de cadenas o grupos. El problema se minimiza mediante el uso de frascos en agitación, y un simple examen microscópico puede determinar si se necesitan técnicas más enérgicas. Otros inconvenientes del método de recuento en placa es que no se obtienen resultados inmediatos y se consume gran cantidad de tiempo, especialmente cuando se requiere una gran cantidad de datos. No obstante, esta técnica ha sido utilizada como método estándar de referencia para los métodos alternativos indirectos que se han ido desarrollando (medidas de densidad óptica e impedancia, radiometría, determinación de ATP, flujo citométrico, etc.).

Una de las ventajas del recuento en placa es que el límite inferior de detección es tan bajo como 20 ufc/ml. El muestreo repetido del mismo frasco produce curvas más precisas que el muestreo de diferentes frascos para cada tiempo, pero incrementa la posibilidad de contaminación. Otra de las ventajas del recuento en placa es que determina sólo células viables y que puede ser usado para realizar recuentos microbianos tanto en alimentos como en medios líquidos de laboratorio (McMeekin y col., 1993).

Con el fin de paliar los inconvenientes del método de recuento en placa, se han desarrollado métodos rápidos y automáticos para la generación de datos, como la

turbidimetría y la conductividad u otras medidas eléctricas, con consideraciones similares al método turbidimétrico (Owens y col., 1989; Cuppers y Smelt, 1993).

La conductividad mide los cambios en las propiedades eléctricas del medio como resultado del crecimiento microbiano o metabolismo celular. Este método tiene como principal ventaja su automatización y su capacidad para el seguimiento simultáneo de muchas muestras. Sin embargo, elevados números de células (aproximadamente 107- 108 ufc/ml) son necesarios para detectar señal, y la magnitud de la señal varía con el pH y la concentración salina. Además, este método automático puede tener una peor interpretación que el recuento total en placa (Krist y col., 1998).

La turbidimetría es otro método indirecto que permite estudiar el crecimiento bacteriano a partir las medidas de la densidad óptica, el cual hace posible seguir el crecimiento de una población bacteriana en tiempo real (Begot y col., 1996).

El fundamento de la técnica turbidimétrica se basa en que las células bacterianas suspendidas en un medio líquido transparente son capaces de absorber y dispersar un haz luz incidente dependiendo de su concentración, tamaño, forma, como también de su índice de refracción y longitud de onda. El crecimiento bacteriano da lugar a un incremento de la turbidez de la suspensión. La relación entre la proporción de luz que atraviesa la suspensión y la concentración de células (o densidad de población) es la siguiente:

donde: Iincidente, es la intensidad de luz que entra en la suspensión; Itransmitida, es la

intensidad de luz que dispersa la suspensión; x, es una constante dependiente de las características del medio y de las células bacterianas; l, es la longitud del paso de luz; c, es la concentración de células.

La relación log Iincidente/Itransmitida, se corresponde con el valor de absorbancia, o

densidad óptica que puede ser detectada y medida por un espectrofotómetro. La medición de la densidad óptica es rápida, sencilla, y puede ser automatizada con instrumentos especializados, permitiendo obtener muchas medidas de un solo cultivo en función del tiempo o temperatura de incubación, por ejemplo.

xcl I I a transmitid incidente ₌₋ log (22)

Este método tiene una serie de ventajas, como que es una técnica rápida, fiable, no destructiva y económica, es relativamente fácil de automatizar y permite realizar el seguimiento simultáneo de gran número de muestras. No obstante, como inconvenientes se describen una baja sensibilidad (es necesario una densidad de población de 105- 106 para obtener señal de medida) y una relación no directamente proporcional entre las medidas de densidad óptica y los recuentos en placa cuando las densidades celulares son elevadas. Además, este método automático puede tener una peor interpretación que el recuento total en placa (Krist y col., 1998).

Una de las limitaciones de las lecturas de absorbancia es que necesitan de un medio líquido de suspensión claro. Farkas y Mohácsi-Farkas (1998), describieron otras limitaciones, como el hecho de que la relación entre la concentración celular y la absorbancia es lineal únicamente en un rango limitado de concentración. Este rango está determinado por el límite de detección inferior, del orden de 106 células/ml, y el límite superior, que normalmente es menor que la concentración celular al comienzo de la fase estacionaria, por lo que, la determinación de la fase de adaptación sólo puede hacerse en cultivos densos.

En microbiología predictiva los datos son expresados normalmente en términos de parámetros de crecimiento microbiano, los cuales se pueden obtener también a partir de cambios en la densidad óptica en el rango donde la respuesta es lineal con la concentración celular. Lack y col. (1997) estudiaron el crecimiento de Enterobacter cloacae, E. coli y L. monocytogenes en caldo Standard-I y en jugo de lechuga por medidas turbidimétricas. Ross y McMeekin (1991) desarrollaron un modelo de crecimiento de S. aureus en medio líquido basado en lecturas de densidad óptica. Posteriormente Dalgaard y col. (1994) determinaron la relación existente entre la µmax

obtenida a partir de recuento en placa y datos turbidimétricos para un amplio rango de especies bacterianas, con el fin de estimar el potencial de los métodos turbidimétricos en microbiología predictiva. Estos autores concluyeron que las medidas turbidimétricas pueden ser usadas con seguridad para estimar el parámetro cinético µmax. Científicos

noruegos y suecos (Nerbrink y col., 1999) han desarrollado un modelo polinómico basado en datos de absorbancia para predecir el crecimiento de L. monocytogenes en medio líquido. En los últimos años, diversos trabajos científicos siguen constatando que la turbidimetría es un método adecuado para la elaboración de modelos de crecimiento

de microorganismos, tal y como desarrollaron Barco (2001) y Castillejo- Rodríguez y col. (2002) para E. coli y S. aureus.

Existen diversos aparatos para realizar medidas turbidimétricas, entre los que destaca el analizador Bioscreen C (Labsystem, Finlandia), espectrofotómetro que mide, a lo largo del tiempo, la turbidez de un cultivo líquido por trayectoria vertical, proporcionando rápidamente una gran cantidad de datos por cultivo. Una de las fundamentales ventajas del aparato es que todas las funciones del analizador son controladas por medio de un software, facilitando el trabajo en gran medida. De este modo, se pueden seleccionar diferentes parámetros, como la longitud de onda del filtro (405-600 nm), temperatura de incubación, frecuencia de agitación e intensidad, intervalo de tiempo entre dos medidas y duración del experimento. El Bioscreen C ofrece además la posibilidad de obtener gran cantidad de réplicas, que garantizan idénticas condiciones de incubación, lo que permite obtener satisfactoriamente datos para la microbiología predictiva. La gran versatilidad de este sistema turbidimétrico se basa, entre otras propiedades, en la posibilidad de trabajar de forma conjunta con un número elevado de muestras, hasta 200 muestras por experimento, que pueden además presentar diferentes condiciones experimentales (Barco Alcalá y col., 2000).