AFLPs

Para la estandarización del protocolo AFLP se utilizaron inicialmente las combinaciones sugeridas en el “kit” y que han sido evaluadas en Colletotrichum

spp. y otras dos combinaciones (EAC-MA, EAC-MC, EA-MT Y EC-MG) fueron escogidas para obtener mayores patrones de bandas reproducibles. Aunque con la combinación EAC-MC se obtuvo una mayor cantidad de bandas (43) y una mejor densidad de marcadores polimórficos (Figura16). Las bandas que se tuvieron en cuenta por su resolución en el gel, fueron aquellas que estuvieron entre 40pb y 200pb. Con la información obtenida en el gel de poliacrilamida, se elaboró la matriz básica de ausencia (0) y presencia (1) de bandas (Anexo 13) y se construyó la matriz de similaridad genética (Anexo 14) utilizando el índice de Dice a partir del cual se realizó el análisis de agrupamiento UPGMA y se construyó el dendograma que se muestra en la figura 17.

El OTU correspondiente al inóculo de Peronospora farinosa f. sp. spianciae de la finca “La Palestina” del municipio de Tabio fue el más distante con un coeficiente de 0.45. Los OTUS que pertenecían a los inóculos procedentes de la finca de “El Hoyo” (Cota) y la finca de “El Cucharo” del municipio de Tenjo mostraron gran similitud (0.75); y por último el OTU del inóculo de la finca de “Alcalá” (Cota) fue genéticamente más cercano al grupo que incluye los OTUS de la finca “El Hoyo” (Cota) y “El Cucharo” (Tenjo) con un coeficiente de 0.48. El resultado del análisis de AFLPs con las combinaciones de iniciadores evaluadas mostró que ninguno de los OTUS presenta un patrón de bandas igual al de otro (Figura 16). .

Un resultado muy importante al realizar AFLPs es obtener bandas únicas que pueden ser utilizadas para el diseño de iniciadores específicos de cada especie y así permitir la identificación de una sola cepa o aislamiento de determinada población. Los resultados obtenidos indicaron bandas únicas por inoculo de

Peronospora farinosa f. sp. spinaciae. Para la finca de “Alcalá” del municipio de Cota se generaron 3 bandas, para el inoculo de la finca de “El Hoyo” se obtuvo una sola banda, en el caso de la finca “La Palestina” de Tabio se obtuvo 5 y por último 2 bandas para el inoculo proveniente de la finca “El Cucharo” de Tenjo. Este resultado sugiere que es necesario evaluar nuevas combinaciones de iniciadores que como en este caso generen bandas únicas que permitan

establecer una relación clara con la identificación de razas en los genotipos diferenciales.

Figura 16. “Huellas genéticas” obtenidas con AFLPs. Combinación de iniciadores EAC-MC. 1.)

Finca “Alcalá” (Cota). 2.) Finca “El Hoyo” (Cota). 3.) Finca “La Palestina” (Tabio). 4.) Finca “El Cucharo” (Tenjo). Fuente: Autor

Figura 17. Dendograma obtenido mediante el análisis de los AFLPs con el Coeficiente de Dice y el algoritmo UPGMA. Finca “Alcala” de la vereda de Rozo (Cota). Finca “El Hoyo” de la vereda

7. DISCUSION DE RESULTADOS

Los cultivos de hortalizas son de gran importancia agrícola en nuestro país por su demanda a nivel local, por su potencial para exportación y por ser materia prima para la agroindustria. Las hortalizas son un producto que se comercializa generalmente en fresco, lo que obliga a los productores a mantener altos estándares de calidad e inocuidad. La espinaca hace parte de las hortalizas de hoja que son importantes en Colombia por su producción y rendimiento (Agronet, 2006). Con el fin de brindar alternativas para el control del mildeo velloso, principal enfermedad de la espinaca, este estudio determinó las razas del patógeno que se encuentran presentes en la Sabana de Bogotá. Para la obtención de inóculo fresco de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae se escogió el municipio de Cota por ser el mayor productor de espinaca en la Sabana de Bogotá (DANE, 2002). Este sitio ha sido seleccionado para la identificación de las principales arvenses (Rodríguez et al., 2008) y las principales plagas (Gil et al., 2007) asociadas al cultivo. También se seleccionaron los municipios de Tabio y Tenjo en donde se cultiva espinaca en menor proporción.

En los tres municipios la siembra de espinaca es permanente, no existe rotación de cultivos y los principales cultivos cercanos son de hortalizas como lechuga, cilantro, rábano, acelga, remolacha, perejil y algunas pertenecientes a la familia

Brassicaceae como Brócoli, Coliflor y repollo. El mildeo velloso es la principal enfermedad que afecta los cultivos de espinaca en muchas áreas productoras alrededor del mundo, causando pérdidas económicas obligando a los agricultores a aplicar fungicidas químicos (Brandenberger et al., 1992; Irish et al., 2003; Satou et al., 2006). Se conocen 10 razas de Peronospora farinosa f. sp.

spinaciae descritas en Estados Unidos y Europa. Estas razas han sido identificadas de acuerdo a la susceptibilidad o resistencia que presentan los diferentes genotipos de espinaca frente a inóculos aislados de diferentes zonas donde se cultiva esta hortaliza (Irish et al., 2008).

De acuerdo con los resultados obtenidos utilizando la metodología propuesta por Correll et al., 2005, se encontraron solamente dos razas (5 y 8) de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae. En las muestras provenientes de los cultivos de la finca “Alcala” del municipio de Cota y la finca “La Palestina” del municipio de

Tabio seidentificó la raza 5, este resultado se basa en la información obtenida con la prueba de diferenciales en la cual se determinó una susceptibilidad del 20% para el genotipo Bolero cultivado en la finca “Alcalá” (Cota) y 17% para el mismo genotipo en la finca “La Palestina” ubicada en el municipio de Tabio. Para los genotipos Viroflay, Resistoflay y Campania se obtuvo una susceptibilidad mayor del 85% para ambos municipios. Esta raza fue identificada en el estado de California en 1997 (Correll et al., 1998); en Europa se reconoció en 1998 por Schafer (no publicado), en cultivos en Chiba, Japón se describió en 2003 (Satou

et al., 2006) y por último en el estado de Florida, Estados Unidos (Irish et al.,

2004).

De otra parte en la finca “El Hoyo” en el municipio de Cota y la finca “El Cucharo” en el municipio Tabio se observó una susceptibilidad del 18 y 21% respectivamente en el genotipo Dolphin mientras que los genotipos Viroflay, Resitoflay y Campania presentaron una susceptibilidad mayor al 85% en ambas localidades. Estos resultados no permiten identificar una raza particular. Sin embargo a través del soporte científico brindado por el doctor Correll de la Universidad de Arkansas (comunicación personal) quien realizó un análisis que incluye el genotipo Tarpy del cual no se conocía la respuesta frente a la inoculación del patógeno, se determinó que se trata de la raza 8.Esta raza junto con las razas 9 y 10 se identificaron recientemente en California y Arizona (Irish

et al., 2007).

En los últimos años se ha observado que las variedades de espinaca consideradas resistentes han sido atacadas por mildeo velloso, demostrando que el patógeno ha logrado superar las barreras de la resistencia obtenida a través del mejoramiento genético. El mecanismo por el cual nuevas razas se desarrollan y se distribuyen aun no es conocido (Irish et al., 2003). Existen muchas variables que pueden contribuir a la aparición de razas en diferentes lugares, una de ellas puede ser atribuida al frecuente uso de fungicidas con ingrediente activo metalaxyl + mancozeb. Este fungicida sistémico es absorbido por las raíces y transportado a través del cuello y tronco de las plantas. Este producto se aplica de manera preventiva para reducir la propagación del patógeno (Brandenberger et al., 1991).

Según Dainello et al., 1990, la eficacia de tres aplicaciones de un fungicida con componente activo metalaxyl para el control de Albugo occidentales que causa la roya blanca en la espinaca (Spinacia oleracea) es determinante en la susceptibilidad y la resistencia parcial del cultivo; metalaxyl en ambos cultivares retrasa el desarrollo de síntomas iniciales de la roya blanca pero no reduce el rango de progreso de la enfermedad. El fungicida con principio activo metalaxyl + mancozeb es utilizado para el control del mildeo velloso en tres de las fincas muestreadas ( “El Hoyo” en Cota, “El Cucharo” en Tenjo y “La Palestina” en Tabio), en donde se realiza de una a tres aplicaciones en un solo ciclo del cultivo. Por otro lado existen otros fungicidas utilizados para el control de mildeo velloso en Cota como: Mancozeb + Metalaxyl, este producto es aplicado a razón de 2.68 Kg/Ha por ciclo, cuando la dosis recomendada son de 1.70 kg/ha, el Oxicloruro de Cobre se aplica en 1.15 Kg/Ha y la dosis recomendada para un ciclo es de 2.65 kg/ha y por último Propineb que se utiliza 0.16Kg/Ha en una sola dosis y la recomendada es de 2.65 Kg/Ha (Datos no publicados).

Otras variables que influyen en la aparición de razas son las condiciones climáticas, debido a que cambios significativos en factores como: temperatura, humedad relativa y precipitación afectan aspectos de la biología del patógeno (Irish et al., 2003). Las altas precipitaciones durante el muestreo, generaron periodos prolongados de humedad que pudieron ser favorables para la infección del patógeno aumentando las poblaciones del mismo. Irish et al (2003) afirman que las altas precipitaciones (85.3cm) registradas durante 1998 en los estados de Florida y Arkansas en Estados Unidos como consecuencia de los fenómenos de la Niña y el Niño pudo ser un factor determinante en la aparición de tres nuevas razas.

La aparición de razas como la 5 y 8 puede ser consecuencia de introducción de semillas infectadas. Inaba et al., 1983 e Irish et al., 2003 realizaron un ensayo que consistió en tomar oosporas colectadas por el método de lavado en varias semillas comerciales, las cuales fueron sembradas en suelo estéril y mantenidas en cámara húmeda a 15°C bajo luz natural. Como resultado obtuvieron un alto porcentaje de infección indicando que el patógeno puede transmitirse por semilla. La presencia de las razas 5 y 8 en la Sabana de Bogotá puede ser posible debido a que el material genético empleado como semilla (variedades y/o híbridos) es importado de Estados Unidos por diferentes casas comerciales a

las que solo se les exige el tratamiento con el fungicida Thiram y la ausencia de patógenos como: Colletotrichum dematium f. sp. spinaciae y Fusarium oxysporum. (ICA <online>, 2008)

En la Sabana de Bogotá usualmente los productores utilizan los híbridos Quinto®, Select 424®, Bandolero® y Corona Superior® (Rodríguez et al., 2008). Los híbrido Quinto® y Bandolero® de acuerdo con la información suministrada por la compañía semillas Arroyave (Semillas arroyave <online>, 2008) son resistentes a las razas 1, 2 ,3 y 4. Este hecho se confirmó por la presencia de las razas 5 y 8 en las fincas “El Hoyo” y “Alcala” del municipio de Cota donde se cultiva el híbrido Quinto®. Con respecto a los híbridos Corona superior® y Grenell® que son utilizados como material de siembra en Tabio y Tenjo no se conoce ningún dato con respecto a la susceptibilidad o resistencia frente a las razas reportadas mundialmente.

Una posible razón para explicar la presencia de estas razas en nuestro país puede estar asociada a la mutación de una raza existente de mildeo velloso y su posterior selección (Brandenberger et al., 1991). Según Wellings et al., 1990 el origen de la mayoría de nuevos fenotipos de P. striiformis f. sp. tritici están relacionados con mutaciones espontáneas, las cuales contribuyen a la variación original en muchas poblaciones de patógenos. Por otro lado Goodwin et al.,

1995 afirman que la rápida evolución de la virulencia entre linajes clonados ha generado una diversidad genotípica en poblaciones de el oomycete

Phytophthora infestans.

Una vez identificadas las razas en los tres municipios de la Sabana de Bogotá se procedió a realizar el estudio preliminar de la diversidad genética. Las marcadores moleculares, ITSs y AFLPs, se constituyen en una herramienta útil para caracterizar genéticamente hongos fitopatógenos (Lindqvist et al., 1998).

Peronospora farinosa f. sp. spinaciae es un parásito obligado y no crece en un medio artificial, Este hecho sumado a la presencia de otros hongos saprófitos, hacen difícil su detección o identificación en la planta (Lindqvist et al., 1998). Por esta razón es de gran importancia la observación microscópica del patógeno con

el fin de identificar estructuras características del género como esporangióforos con ramificaciones dicotómicas, esporangios e hifas cenocíticas.

Está documentado que las comparaciones de las secuencias de rADN proveen resultados para el análisis de relaciones filogenéticas en varios niveles taxonómicos (Lee et al., 1992). Las regiones de ITS y la región nuclear intergénica de la unidad repetitiva de rRNA evolucionan rápidamente y debe variar entre especies y poblaciones (Ristaino et al., 1998; Sheriff et al., 1994). En este estudio se utilizaron los iniciadores universales ITS1 y ITS4, que han sido empleados para amplificar las regiones ITS en varios hongos entre los que se cuentan parásitos obligados como Peronospora sparsa (Linqvist et al., 1998).

Como producto de la amplificación de la región ITS con los iniciadores ITS1 e ITS4 se obtuvo un fragmento entre 750-800pb. Choi et al., 2006 reportan productos de amplificación de 798pb utilizando combinaciones de los iniciadores ITS1, ITS2, ITS3 y ITS4 en tres diferentes aislamientos de Peronospora farinosa

f. sp. spinaciae). El fragmento amplificado en este trabajo (/750 – 800 pb) confirma que posiblemente se trate del patógeno que causa el mildeo velloso en espinaca. Sin embargo es conveniente realizar el análisis de restricción con endonucleasas que permitan la detección de polimorfismos entre diferentes secuencias amplificadas (Buscot et al., 1996). Casimiro et al., 2004, utilizado las enzimas RsaI, Sau3AI y HpaII lograron obtener polimorfismos entre diferentes aislamientos de Peronospora destructor patógeno en cultivos de cebolla.

La técnica de “fingerprinting” utilizada para abordar el estudio de la diversidad genética de los cuatro inóculos obtenidos fue AFLP. Este marcador es altamente reproducible, genera mayor grado de polimorfismo y es más confiable que otros marcadores como RAPDs y RAMs (Van der Lee et al., 1997). Los AFLPs son usados hoy en día para estudios de variación genética en hongos (Lindqvist et al., 2002). Una de las mayores ventajas del AFLP es que utiliza una pequeña cantidad de ADN genómico para producir cientos de marcadores. Este hecho es esencial en organismos biotróficos como Peronospora sparsa (Lindqvist et al., 2002) y Peronospora farinosa (Danielsen et al., 2004) que esporulan débilmente limitando la cantidad de material disponible para la extracción de ADN.

La técnica de AFLPs mostró ser resolutiva, pues con una sola combinación de iniciadores (EAC-MC) se logró obtener un total de 43 bandas (figura 16). Con las otras tres combinaciones evaluadas se obtuvieron en promedio 15 bandas por inóculo del patógeno. El número reducido de bandas y su poca resolución puede ser atribuida a la digestión incompleta del ADN genómico. En el gel de poliacrilamida se observaron zonas de bandeo comunes entre las cuatro fincas así como regiones con una diferencia marcada entre los mismos. Estos resultados son consistentes con los obtenidos por Lindqvist et al., 2002, quienes con una sola combinación de iniciadores obtuvieron 52 bandas distribuidas entre 76 y 300pb por aislamiento de Peronospora sparsa agente causal del mildeo velloso en rosa. La reproducibilidad de la técnica fue evaluada con dos extracciones diferentes de ADN.

El dendograma (Figura 17) obtenido a partir de la matriz de similitud mostró tres grupos diferentes. En el primer grupo se encuentra el inóculo de la finca “El hoyo” del municipio de Cota y el inóculo de la finca “El Cucharo” del municipio de Tenjo con el mayor coeficiente de similitud (0.75), indicando que estos dos OTUS de Peronospora farinosa f. sp. spinaciae no generaron ningún morfotipo similar a ninguno de los otros dos inóculos del patógeno. El siguiente grupo está conformado por el inóculo de la finca de la finca “Alcalá” del municipio de Cota que tuvo un coeficiente de similitud de 0.48 con respecto al grupo anterior. El último grupo correspondió al inóculo de la finca “La Palestina” del municipio de Tabio con un coeficiente de 0.45 respecto a los otros dos grupos mostrando la mayor distancia genética.

Al comparar los resultados obtenidos por diferenciales para la identificación de razas (Tabla 8) con los resultados del estudio preliminar de la diversidad genética basados en AFLPs, se observó que los dos inóculos de la raza 8 identificada en las fincas “El Hoyo” y “El Cucharo” presentaron una similitud del 0.75 y se encontraron formando un mismo cluster (Figura 17). Con respecto a la raza 5 identificada en las fincas de “Alcalá” y “La Palestina” se observó que aunque no formaron un mismo cluster presentaron una similitud de 0.45 entre ellas. Esto indica que aunque se trate de la misma raza tienen diferencias genotípicas y por esta razón el análisis UPGMA agrupó estas razas en dos clusters diferentes.

Observando el resultado del gel de poliacrilamida se evidenció la presencia de 11 bandas únicas distribuidas en los cuatro inóculos del patógeno. Aunque la presencia de bandas únicas permite el diseño de iniciadores específicos, el gran número de estas bandas dificulta el diseño debido al polimorfismo presentado para cada inóculo. Esto indica que es necesario utilizar más combinaciones de iniciadores para disminuir la cantidad de bandas únicas y aumentar la resolución de bandas polimórficas.

En conclusión los resultados de la identificación de razas a través de genotipos diferenciales pueden ser parcialmente comparados con el estudio preliminar de la variabilidad genética. Aunque el análisis molecular es confiable se recomienda el uso de cultivos monospóricos que generen mayor confiabilidad en el estudio preliminar de la variabilidad genética de Peronospora farinosa f. sp.

Spinaciae.

En el caso del control de mildeo velloso en estados de Florida y California en Estados Unidos se han empleado variedades y/o híbridos resistentes para el manejo de este problema sanitario como: el híbrido Lazio que tiene hojas lisas redondas de color oscuro y que presenta una resistencia contra las razas 1 a 7 del mildeo velloso (Gourmet Seed Internacional <online>, 2008). En las condiciones de la Sabana de Bogotá esta alternativa no ha sido implementada por el desconocimiento del número de razas de Peronospora farinosa f. sp.

spinaciae presentes. Es por esta razón que los productores emplean como único método de control productos de síntesis química.

Los resultados obtenidos en esta investigación permitirán re-direccionar las estrategias en el manejo de esta enfermedad, ya que con la identificación de la raza 5 y 8 en estas cuatro fincas de los municipios de Cota, Tabio y Tenjo los productores podrán acceder a semillas de genotipos resistentes. Por otro lado, los importadores de semillas también deben promover la entrada de nuevos genotipos resistentes a las razas 5 y 8 como: Lion y Lazio.

Igualmente se deben valorar características morfológicas de las hojas que son muy importantes en la aceptación del producto en el mercado, la tolerancia a las condiciones climáticas de la Sabana de Bogotá, el rendimiento y la precocidad.

Además el agricultor es muy exigente con las características físicas de la hortaliza, ya que prefieren la espinaca cuatro puntas de color verde oscuro y con un alto rendimiento.

El uso de híbridos resistentes a las razas 5 y 8 permitirá por un lado, reducir el uso de productos químicos que deterioran el suelo y medio ambiente y de otra parte producir una mejor calidad de espinaca para el consumidor. Estas acciones están encaminadas al desarrollo de estrategias para el manejo de esta enfermedad bajo esquemas de producción limpia.

8. CONCLUSIONES

Se identificaron las razas 5 y 8 de Peronospora farinosa f. sp spinaciae en los tres municipios de la Sabana de Bogotá. La raza 5 está presente en la finca “La Palestina” en el municipio de Tabio y en la finca “Alcalá” en el municipio de Cota; Por su parte la raza 8 se encontró en la finca “El Cucharo” en los municipios de Tenjo y la finca “El Hoyo” en el municipio de Cota.

Los híbridos cultivados actualmente en los municipios de Cota, Tenjo y Tabio (Bolero® y Quinto®) son susceptibles a las razas 5 y 8 identificadas en este trabajo y a las razas 1, 2, 3 y 4 de Peronospora farinosa f. sp spinaciae

identificadas por Correll y colaboradores previamente. La variedad Viroflay, susceptible a las 10 razas reportadas, fue susceptible a las razas 5 y 8con inóculos de la sabana de Bogotá.