Diversidad genética de Peronospora farinos a

Para tener un panorama general de la diversidad de P. farinosa, las hojas muestreadas en las cuatro fincas se lavaron cuidadosamente con agua destilada para eliminar residuos de suelo y otros elementos. Posteriormente se realizó una observación microscópica con azul de lactofenol para reconocer los esporangios y esporangióforos. Una vez confirmada la presencia del hongo, las muestras fueron almacenadas a -20°C. Los esporangióforos y esporangios congelados fueron retirados con ayuda de una espátula delgada previamente autoclavada y se colocó en tubos de 1.5 ml. El micelio externo obtenido de las hojas de cada cultivo fue reunido para obtener un “pool” del patógeno por finca.

5.4.1 Extracción de ADN

Se probaron los protocolos de extracción de ADN propuestos por Lindqvist et al

(1998), Ristaino et al (1998) y Judelson et al (1996). Se escogió el protocolo de Judelson y sus colaboradores por la calidad, pureza y cantidad de ADN obtenida.

La Extracción de ADN se realizó a partir de esporangióforos y esporangios obtenidos empleando el protocolo propuesto por Judelson et al., 1996. Para

esto se tomó entre 5 y 15mg de inóculo puro del patógeno y se colocó en tubos eppendorff de 1.5 ml. A cada tubo se agregó 400 µl de buffer de extracción (Tris HCL 0.2M pH 8.5, NaCl 0.25M, EDTA 0,025M) (Anexo 3), se llevó a un beaker con agua en ebullición durante 5 minutos y se adicionó 400 µl de fenol:cloroformo 1:1 (Anexo 4). Esta mezcla se colocó en el vortex por 5 minutos y se centrifugó a 7000 rpm durante 10 minutos (Jouan®). El sobrenadante se transfirió a un tubo de eppendorf nuevo al cual se le adicionó 2 volúmenes de etanol absoluto frío y se dejó precipitar a -20°C por una hora. Posteriormente se centrifugó a 10000 rpm por 15 minutos y el sobrenadante fue descartado El pellet se lavó con etanol al 70% y se centrifugó de nuevo durante 3 minutos a 4000rpm. El pellet se dejó secar durante 15 minutos manteniendo en posición vertical el tubo de eppendorf sobre una toalla absorbente y el ADN fue resuspendido en 50 µl de agua HPLC.

5.4.1.1 Evaluación espectrofotométrica del ADN.

La pureza y concentración del ADN se evaluó en un equipo NanoDrop 1000de Thermo Scientific®. El procedimiento consistió en colocar una alícuota de 2µl de ADN purificado. Primero se analizó la cantidad de ácidos nucleicos y posteriormente se calculó el valor de la relación a260/280 para determinar la pureza del ADN extraído de cada muestra de acuerdo a la siguiente formula:

[ADN] µg/ml = A260x FDx50.

5.4.1.2 Evaluación electroforética del ADN.

La calidad del ADN se evaluó por electroforesis en un gel de agarosa 0.8% en buffer TAE 1x (Tris-acetato) teñido con Bromuro de Etidio (EtBr) 0.5µg/ml de acuerdo con el protocolo propuesto por Sambroock et al., (1989) (Anexo 6), El corrido se llevó a cabo en una electroforético cámara Thermo EC330 Midicell®

Primo. El peso molecular del ADN obtenido se evaluó por comparación visual con los marcadores de tamaño molecular 100kb (Promega®), bajo luz ultravioleta. Los geles fueron fotografiados en el equipo Gel documentation de Biorad®.

5.4.2 PCR con iniciadores específicos para amplificación de ITS.

Para la amplificación de los espaciadores internos ITS1-ITS2 se utilizaron los iniciadores universales ITS1 e ITS4 (Lindqvist et al., 1998) (Tabla 5). La mezcla de reacción contenía 2µl de ADN diluido (1:10), buffer PCR 1X, 2mM MgCl2, 200

µM de la mezcla de dNTPs, 0.2 µM de cada primer y 0.75U/15µl de Taq DNA polimerasa para un volumen total de 15µl. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un termociclador MJ PTC-100 con el siguiente perfil de temperaturas: denaturación inicial a 95°C durante 5 min, 35 ciclos de 1.5 minutos a 95°C, 2 minutos a 56°C y 3 minutos a 72°C; y una extensión final de 5 minutos a 72°C (Casimiro, et al., 2004). Los productos de amplificación se corrieron en gel de agarosa al 1.5%, en 1X TBE (0.09MTris, 0.09M borato de sodio y 2.4mM EDTA pH 8.3) a 60 V por 1h, usando el marcador1kb (Promega®) y fueron visualizados y fotografiados un equipo Gel Documentation de Biorad®.

Tabla 4. Secuencia de los iniciadores utilizados para la amplificación de las regiones ITS. Fuente: Lindqvist et al., 1998

Iniciadores Secuencia bases

ITS1 (forward) ITS4 (reverse) (5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´) 19 20 5.4.3 Técnica AFLP

La amplificación aleatoria de fragmentos de ADN genómico digerido se llevó a cabo empleando el protocolo que acompaña el kit “.AFLP® Analysis System for Microorganisms” de Invitrogen life technologies® (Anexo 7), con las siguientes modificaciones:

- Digestión de ADN genómico: Cada muestra de ADN se ajustó a una concentración de 100ng/μl. La restricción se realizó con las enzimas Mse I de corte poco frecuente y EcoRI de corte frecuente. El volumen final de la reacción fue de 12.5μl que contenían 2.5μl de buffer 5X, 1μl de la mezcla de las enzimas y 5μl de ADN de cada muestra. Como control positivo se utilizó DNA de E. coli a una concentración de100ng/μl. La reacción se incubó a 37°C por 2 horas. - Ligación de Adaptadores: En este caso se utilizó la solución de ligación que contenía los adaptadores de EcoRI / Mse I. Se tomaron 11μl de la reacción de

restricción y 1μl de T4 ADN ligasa con una concentración de 1U/μl para un volumen final de 12μl, el cual se incubó a 20°C por 2 horas. La reacción de ligación se diluyó 1:5 en buffer TE (10mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA).

- Reacción de Preamplificación: En la primera amplificación se utilizaron iniciadores con nucleótidos no selectivos (E+0 y M+0); del primer E-0 se agregó 1.35μl y 6 μl del primer M-0; igualmente se adicionó 2.5μl de buffer 10X con Mg; 0.5μl de la Taq polimerasa (5U/μl); y 2.5μl.del ADN producto de la restricción y ligación. El volumen final de la reacción fue de 25.5μl. Esta preamplificación se realizó en un termociclador MJ PTC-100, con las siguientes condiciones: 20 ciclos a 94°c por 30s, 56°C por 60s y por ultimo 72°C por 1 minuto. El producto de esta reacción se diluyó 1:10 en TE (10mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA).

- Amplificación selectiva: En este último paso se utilizaron iniciadores con nucleótidos selectivos (E+1/M+1 o E+2/M+1) como: EAC-MA, EAC-MC, EA-MT Y EC-MG. Esta reacción utilizó dos mezclas: la primera mezcla tenía los iniciadores de EcoR I y Mse I, en donde se adicionó 0.5 y 4.5 respectivamente. El segundo “Mix” contenía 2μl de buffer 10X; 0.1μl de Taq polimerasa (5U/μl) y 7.9μl de agua destilada. A la reacción final se le agregó 5μl de el ADN diluido (producto de la amplificación); 5μl del “Mix1” y 10μl del “Mix 2”. Las condiciones de PCR que se utilizarón fueron las recomendadas por el protocolo que acompaña el “kit” de Invitrogen.

- Preparación del gel de poliacrilamida: El gel de poliacrilmaida se preparó al 4% 29:1(acrilamida-bisacrilamida) (Anexo 8). Para la polimerización del gel se agregaron 700 μl de Persulfato de amonio y 150 μl de TEMED. A cada una de las muestras (20 μl) se les agrego 3.2 μl de buffer de carga (Anexo 9) y posteriormente se denaturaron durante 4 minutos. La electroforesis se corrió a 110W durante 1 hora y 25 minutos en buffer TBE 1X (Anexo 10), utilizando 4 μl de la reacción de amplificación. El gel fue teñido con nitrato de plata de acuerdo con las indicaciones de Van der Lee et al (1997) (Anexo 11 y 12).

5.4.4 Análisis de la información

Se establecieron los patrones de bandas en cada finca evaluada mediante una matriz básica de presencia y ausencia (1 y 0) (Anexo 13): los pesos moleculares

de cada banda se determinaron teniendo como referencia los pesos moleculares del marcador 10pb (Invitrogen®). Posteriormente, se utilizó el programa NTSYS

versión 2.0 y se construyó la matriz de similaridad genética utilizando el índice de Dice a partir del cual se realizó el análisis de agrupamiento UPGMA (Anexo 14) y el correspondiente dendograma.

6. RESULTADOS