AISLAMIENTO DE ISLOTES PANCREÁTICOS MEDIANTE DIGESTION CON COLAGENASA

El objetivo de esta técnica era eliminar de la muestra la porción correspondiente al tejido exocrino, que es el mayoritario en el páncreas. Era imprescindible seguir un protocolo de purificación de islotes pancreáticos, ya que en nuestro caso nos interesaba analizar específicamente la población de células infiltrantes en los islotes, y no los leucocitos que se pueden encontrar diseminadas en el tejido intersticial o circulando por los vasos sanguíneos.

Se utilizó Colagenasa tipo IV (CLS-4, Whortington) para disgregar el páncreas con el fin de poder aislar los islotes; a diferencia de otras enzimas como la tripsina, la colagenasa tiene un menor efecto proteolítico sobre las proteínas que se encuentran en la superficie celular, lo cual es de vital interés para el posterior análisis de marcadores de superficie. La colagenasa se utilizó a una concentración equivalente a 470 U/ml, disuelta en HBSS (Hank’s Balanced Salt

Solution 10X, 14060-040, GibcoBrl; diluido 1/10 en agua destilada + 0.35gr/L NaHCO3).

El protocolo quirúrgico seguido consistió en inyectar la solución de enzima colagenasa en el páncreas del animal, utilizando la vías naturales que representan el colédoco y el conducto pancreático. Obstruyendo el paso a través del resto de ramificaciones del colédoco, la colagenasa circula hacia el páncreas y difunde por todo el órgano, sin dirigirse a otros órganos que conectan con el mismo conducto (intestino e hígado). Para el éxito final de esta técnica, era imprescindible que se mantuviera inalterada la anatomía natural de los órganos adyacentes al páncreas, motivo por el cual la extracción del resto de órganos se realizó con posterioridad.

Los animales fueron sacrificados mediante dislocación cervical, y se realizó una incisión longitudinal en la línea media del animal, desde la parte inferior del abdomen hasta el tórax, abriendo lateralmente el campo de intervención en la medida de lo posible. También se retiró el tercio frontal de la caja torácica (costillas y esternón) con el fin de facilitar las siguientes maniobras. Apartando la masa intestinal hacia el lado izquierdo del animal, y un poco por debajo de la unión con el estómago, se localizó y pinzó la ampolla de Vater con una primera pinza tipo mosquito, obstruyéndose así el paso de líquido hacia intestino. Posteriormente se pinzaron también la vesícula biliar, con el segundo mosquito, y la rama lateral del colédoco, que se dirige hacia el hígado, con el tercer mosquito. De esta manera se obstruyó también el paso de líquido hacia el hígado (Fig. 13-A). Mientras el conducto colédoco se mantenía tenso mediante los mosquitos, éste fue canulado con una aguja de 30G, aprovechando el apoyo de una pinza fina dentada para sostener la aguja en el interior del conducto (Fig. 13-B). Tras la inyección de 3 ml de colagenasa fría, se comprobó que ésta había sido distribuida por todo el páncreas (Fig. 13-C).

Figura 13. Protocolo de inyección de colagenasa en páncreas. A. Pinzamientos a nivel de la ampolla de Vater (1), de la vesícula biliar (2) y de la ramificación hepática izquierda del colédoco (3). B. Inyección de colagenasa a través del colédoco. C. Detalle del páncreas dilatado, tras la inyección de colagenasa.

Tras la inyección de colagenasa, se procedió a la extracción de los órganos de interés. En primer lugar se extrajeron los ganglios linfáticos mesentéricos, que se encuentran formando una cadena en la línea media del mesenterio. A continuación se apartó cuidadosamente el intestino en toda su longitud, dejando al descubierto el páncreas en su totalidad. Posteriormente se recogió el bazo. Dejando a un lado el páncreas, se podían visualizar los ganglios pancreáticos, adyacentes a la cabeza del páncreas, por debajo del estómago. Estos ganglios regionales fueron extraídos aplicando una ligera tracción con unas pinzas. Estas tres muestras se recogieron en tubos conteniendo suero fisiológico frío, y fueron mantenidas en hielo, con el fin de evitar la actividad enzimática de la colagenasa (por si algún pequeño volumen hubiese ido a parar a éstos órganos durante la extracción, debido a su proximidad

física con el páncreas). A continuación se extrajo el páncreas, inyectado previamente con colagenasa, evitando la grasa adyacente, ya que ésta dificulta el posterior procesamiento del órgano. El páncreas así obtenido fue mantenido también en un tubo en hielo (sin suero fisiológico en este caso) hasta el momento de la digestión.

La digestión del páncreas con la enzima colagenasa se realizó incubando la muestra en un baño a 37ºC durante 20 minutos, tras los cuales se paró la digestión añadiendo 50 ml de HBSS frío. A continuación el tejido fue disgregado mecánicamente con una pipeta de 10 ml hasta obtener una suspensión homogénea. Tras la sedimentación de la muestra durante 7 minutos en hielo, durante la cual los islotes se depositaron en el fondo del tubo, el sobrenadante fue descartado, ya que contenía mayoritariamente restos de grasa y tejido exocrino. El sedimento fue recuperado y pasado a una cápsula de Petri (90 mm de diámetro), sobre la cual se recogieron los islotes pancreáticos manualmente con una pipeta y la ayuda de una lupa binocular a 15 aumentos (0-6.4X, 475057, Zeiss). Mediante este protocolo, se obtuvieron 50- 200 islotes por muestra, según el grado de insulitis. Finalmente, para obtener una suspensión celular, conteniendo linfocitos infiltrantes de los islotes para su posterior análisis mediante citometría, se procedió a una suave disgregación mecánica de los islotes de Langerhans recogidos, utilizando un homogeneizador manual de pistón (cuerpo de vidrio + émbolo de teflón).