A. P.2 Selección de los vectores de expresión con GFP fusionada en el extremo N ó C-terminal de la
R.4 PqqC: procesamiento endógeno y presentación de ligandos de HLA-B27
D.1.1 Alcance y limitaciones del sistema experimental
En la actualidad se desconoce qué proteínas de Chlamydia trachomatis y por qué mecanismo pueden alcanzar la vía de procesamiento y presentación de MHC de Clase I. Nuestra aproximación, implica la expresión endógena de proteínas bacterianas en células humanas HLA-B27 positivas. La aplicación de este sistema experimental nos ha permitido identificar varios ligandos de Chlamydia
trachomatis derivados de las proteínas bacterianas transfectadas, los cuales se procesan y se presentan in vivo por HLA-B27, (Cragnolini and Lopez de Castro. 2008; Cragnolini et al. 2009). Sin embargo, se
deben considerar varios aspectos. Primero, ¿es nuestra aproximación una alternativa apropiada a la identificación directa de ligandos de Chlamydia trachomatis en células infectadas?. Segundo, ¿alcanzarían las proteínas analizadas la vía de procesamiento y presentación de MHC de Clase I en una infección natural?. Tercero, dado que la sensibilidad de una célula T es mayor que el límite de sensibilidad de las técnicas de MS actuales: ¿es nuestra aproximación suficientemente sensible para detectar ligandos bacterianos y epítopos de CTLs presentados por HLA-B27?.
Los dos primeros interrogantes deben abordarse teniendo en cuenta el mecanismo de cross- presentación antigénica (Lin et al. 2008b). Las células dendríticas endocitan cuerpos apoptóticos y restos celulares de la célula infectada. Tras su captación, las proteínas bacterianas situadas en el compartimiento endosomal de la célula presentadora de antígeno se pueden transferir al citosol por un mecanismo caracterizado parcialmente, que involucra la participación del translocón sec61 (Ackerman et al. 2006). De esta manera, las proteínas bacterianas se incorporarían a la vía de degradación ubiquitina- proteasoma. En principio, cualquier proteína bacteriana que alcance esta vía, puede ser procesada de manera similar a cualquier proteína endógena. No obstante, otras vías independientes de proteasoma pueden contribuir como fuentes potenciales de antígenos, dentro de las cuales podemos citar la fusión de los endosomas con el RE, o el procesamiento en el compartimiento endosomal, seguido del intercambio
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peptídico por moléculas de MHC de Clase I durante el reciclamiento entre este compartimiento y la superficie celular. Sin embargo, la contribución de estos mecanismos alternativos a la presentación de ligandos de MHC de Clase I, se desconoce (Lin et al. 2008a). En consecuencia, podemos afirmar que, en general, la producción de ligandos de HLA-B27 derivados del procesamiento de las proteínas bacterianas sintetizadas de manera endógena, tal y como contempla nuestro sistema experimental, es similar al procesamiento que tendría lugar en el citosol de las células presentadoras de antígeno profesionales, tras una infección. Los candidatos obvios en alcanzar la vía de procesamiento y presentación de MHC de Clase I en células infectadas con Chlamydia trachomatis, son las proteínas secretadas al citoplasma (Kleba and Stephens. 2008), además de otras, como por ejemplo las proteínas de la vacuola bacteriana, las cuales podrían tener acceso a este compartimento celular (Fling et al. 2001; Starnbach et al. 2003). Otras proteínas de Chlamydia trachomatis podrían alcanzar el citosol por mecanismos de cross-presentación aún no caracterizados.
Otra cuestión metodológica reside en la sensibilidad de las técnicas de MS empleadas en esta tesis, en comparación con la extrema sensibilidad de una célula T activada. En nuestras condiciones experimentales, el límite de detección de los ligandos de HLA-B27 se estimó en aproximadamente 100- 200 copias por célula. Por otra parte, la sensibilidad del los CTLs se ha estimado en sólo unas copias de péptido por célula (Sykulev et al. 1996; Purbhoo et al. 2004). Por tanto, nuestra estrategia dista entre uno y dos órdenes de magnitud del límite de detección de una célula T. Sin embargo, la aproximación utilizada provee a la vía de degradación citosólica una cantidad relativamente grande de proteína bacteriana, mucho mayor que una infección natural. Es razonable asumir entonces, que la presentación de péptidos provenientes de la síntesis endógena de la proteína bacteriana, tras su transfección estable, tiene un rendimiento muy superior al número de copias de péptido presentado por HLA-B27 en células infectadas. De esta forma, nuestro modelo experimental permitiría la detección de péptidos que se presentarían en muy baja cantidad en una infección natural. Por esta razón, un péptido bacteriano no detectado en el repertorio peptídico unido a HLA-B27 en nuestro sistema experimental, probablemente no se presentaría en células infectadas con Chlamydia trachomatis. Sin embargo, no se puede descartar formalmente esta posibilidad sólo por criterios bioquímicos.
Como se ha comentado en la Introducción, se deben considerar otras cuestiones metodológicas importantes. El análisis directo de los péptidos presentados por HLA-B27 por MS en células infectadas puede resultar impracticable, debido a la muy baja expresión de antígenos bacterianos en estas células (Ramos et al. 2001; Ringrose et al. 2004). Además, los requerimientos edilicios de bioseguridad para trabajar a gran escala con Chlamydia trachomatis, actualmente son de muy difícil disponibilidad.
63 Finalmente, Chlamydia trachomatis disminuye rápidamente los niveles de MHC de Clase I en la superficie de la célula infectada (Zhong et al. 2000; Zhong et al. 2001). En la aproximación alternativa utilizada en esta tesis, existe una limitación inherente a la técnica de comparación del repertorio peptídico de HLA-B27. Si un péptido de Chlamydia trachomatis tiene el mismo tiempo de retención y la misma masa molecular que un ligando propio del repertorio constitutivo de HLA-B27, este no se reflejará como una señal peptídica diferencial. Por esta razón, no descartamos la posibilidad de que puedan existir péptidos adicionales presentados por HLA-B27, además de los ligandos descritos, que hubieran pasado inadvertidos en las comparaciones de los repertorios peptídicos. Por otra parte, el hallazgo de un ligando expresado diferencialmente en el transfectante estable de la PqqC pero procedente de una proteían humana, indica que la detección de un ión diferencial en nuestro sistema experimental, no necesariamente corresponde a un péptido bacteriano. Para asignar apropiadamente una señal diferencial como un péptido bacteriano específico, es fundamental determinar su secuencia de aminoácidos.