A. P.2 Selección de los vectores de expresión con GFP fusionada en el extremo N ó C-terminal de la
R.4 PqqC: procesamiento endógeno y presentación de ligandos de HLA-B27
D.1.2 Identificación de ligandos de la DNA primasa de Chlamydia trachomatis presentados in vivo por
El segundo objetivo de esta tesis consistió en examinar el posible mimetismo molecular entre ligandos presentados por HLA-B27 derivados de la DNA primasa y ligandos naturales presentes en el repertorio constitutivo de B27. La justificación de esta búsqueda, como se ha comentado, fue el hallazgo en nuestro laboratorio de un péptido perteneciente a los residuos 309-320 derivado del procesamiento de la región intracitoplasmática de HLA-B27 y de otras moléculas de MHC de Clase I (RRKSSGGKGGSY), el cual es un ligando natural de tres subtipos asociados a EA. Este péptido posee una alta homología con los residuos 211-222 de la DNA primasa de Chlamydia trachomatis (RRFKEGGRGGKY). El péptido bacteriano, P(211-222), se une in vitro a HLA-B27, y se genera directamente por el proteasoma a partir de un precursor sintético (Ramos et al. 2002a). Más aún, las formas persistentes de Chlamydia trachomatis, las cuales promueven la cronicidad de la infección y están presentes en los sitios de inflamación de pacientes con ReA inducida por este patógeno, permanecen metabólicamente activas durante la replicación del DNA (Gerard et al. 2001). En consecuencia, la DNA primasa podría estar siendo activamente sintetizada en las formas persistentes de la bacteria, siendo una fuente potencial de antígenos bacterianos en la enfermedad crónica.
En nuestra aproximación inicial para expresar directamente la DNA primasa, nos encontramos con dos problemas. Primero, la transfección directa del gen bacteriano resultó en una transcripción
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activa de éste, pero no se observó evidencia de una traducción significativa de la proteína. Presumiblemente, este hecho se debe a la baja compatibilidad de las secuencias de RNA bacteriano con la maquinaria de traducción eucariota. Para sortear este problema, y monitorizar la expresión de la DNA primasa bacteriana, se fusionó esta proteína al extremo C-terminal de la GFP. Aunque, la proteína de fusión completa se expresó eficientemente en experimentos de transfección transitoria, no se obtuvieron transfectantes estables en la línea celular C1R-B*2705. La expresión de la proteína bacteriana podría interferir con la replicación de DNA humano, compitiendo con la DNA primasa humana por la unión al DNA, además de otros efectos bloqueantes. Por tanto, se diseñaron proteínas de fusión alternativas en donde se escindió el dominio de unión a DNA, P(90-595), o éste y el domino de interacción con la helicasa, P(90-450). La secuencia P(211-222), homóloga al ligando natural de HLA-B27, se localiza en el domino central TOPRIM de la molécula. Ambas construcciones se expresaron de manera estable en C1R-B*2705. Sin embargo, debido a que los niveles de expresión de la construcción más corta fueron mayores a los niveles de P(90-595) observados, se eligió P(90-450) para la subsiguiente caracterización de ligandos bacterianos de HLA-B27.
Los hallazgos principales de este estudio son los siguientes. Primero, el péptido P(211-222), no se produce por el procesamiento endógeno de la proteína bacteriana en células C1R, al menos en los niveles de detección alcanzados en este estudio. Segundo, el péptido relacionado P(211-221) RRFKEGGRGGK se procesó de manera endógena y se presentó por B*2705. No podemos descartar la posibilidad de que P(211-222), u otros péptidos relacionados, P(211-218) ó P(211-223), pudieran ser producidos y presentados por HLA-B27 en cantidades muy bajas. La presentación endógena de P(211- 221) es consistente con la posibilidad de que esta secuencia de la DNA primasa pudiera ser un mediador de mimetismo molecular entre Chlamydia trachomatis y el ligando de HLA-B27 homólogo, siendo relevante en la ReA asociada a HLA-B27. Esta cuestión esta siendo actualmente analizada por cristalografía comparativa de HLA-B27 en complejo con B27(309-320) y P(211-221) (Kumar et al. Datos no publicados).
El procesamiento endógeno y la presentación del péptido P(211-221), pero no de otros péptidos relacionados, tiene dos aspectos notables. Primero, en digestiones in vitro del precursor sintético P(203- 230) con proteasoma 20S purificado se observó, el corte después del residuo Tyr 222, y más eficientemente tras el residuo Ile 223, pero no tras el residuo Lys 221 (Ramos et al. 2002a). En consecuencia, contrariamente a otros ejemplos descritos (Kessler et al. 2001; Alvarez et al. 2001b), el patrón de digestión proteasómico in vitro de la correspondiente proteína, no concuerda con el procesamiento endógeno observado. Segundo, es poco probable que el péptido P(211-221) se presente
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El segundo hallazgo de este estudio fue, la identificación de dos péptidos bacterianos adicionales y estrechamente relacionados entre sí, P(112-121): RRINREAERF y P(112-122): RRINREAERFF, que son presentados por HLA-B27 tras su procesamiento endógeno. Aunque la secuencia peptídica RRINREAER, incluye los motivos de unión principales a HLA-B27, este péptido P(112-120), no se detectó en el pool unido a HLA-B27. No se tiene constancia de ningún ligando natural de B27 que posea a la vez un residuo básico en la posición C-terminal (pΩ) y un residuo ácido en la pΩ-1. Sin embargo, es relativamente frecuente observar un residuo ácido en la pΩ-1, seguido de un residuo alifático o aromático en la pΩ (Lopez de Castro et al. 2004). Una explicación plausible a este hecho, puede ser que la presencia del residuo Glu inmediatamente antes del residuo C-terminal de Arg puede disminuir la eficiencia de corte tras el residuo Arg120. Es bien conocido que los residuos ácidos adyacentes pueden reducir la actividad tríptica del proteasoma tras residuos básicos (Unno et al. 2002). Sin embargo, se han descrito en alotipos de HLA-A, múltiples ligandos naturales con residuos ácidos seguidos de residuos básicos C-terminales (Seeger et al. 1999; Weinschenk et al. 2002; Kruger et al. 2005). Por tanto, es posible que la ausencia de este motivo en los ligandos naturales de B27 no este relacionado con características de procesamiento antigénico, sino más bien con restricciones de unión a HLA-B27.
La observación de que múltiples secuencias humanas mostraron una alta homología con P(112- 121) y P(112-122) sugiere que en el repertorio de B27 podrían existir uno o más ligandos con el potencial de exhibir mimetismo molecular con los péptidos bacterianos. Esta posibilidad se puede abordar realizando una búsqueda específica de los péptidos correspondientes en el pool constitutivo unido a HLA-B27. En este estudio, no se indagó en esa dirección.
El rendimiento relativamente alto de P(112-121) nos permitió determinar, mediante el marcaje isotópico estable con Arg pesada e inhibición del proteasoma, que la proteína de fusión P(90-450) se procesa por la vía proteasómica. No se pudo determinar la dependencia de proteasoma de P(112-122) y P(211-221), debido al bajo rendimiento de estos péptidos. No obstante, en un estudio previo donde se utilizó el mismo método, para examinar la dependencia de proteasoma de los ligandos de B*2705,
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múltiples péptidos derivados de la misma proteína parental mostraron, de manera consistente, el mismo patrón de sensibilidad o insensibilidad frente a los inhibidores de proteasoma (Marcilla et al. 2007).
En su conjunto, los estudios relativos a la DNA primasa de Chlamydia trachomatis validan la aproximación utilizada, al demostrar que la expresión estable de proteínas de fusión bacterianas, seguido del análisis inmunoproteómico comparativo de los repertorios peptídicos, permite la identificación directa de ligandos bacterianos de HLA-B27 procesados endógenamente.