En la presente tesis se presentan además de la estructura de NtcA en las formas activa e inactiva, las estructuras de tres complejos entre proteínas que involucran a cuatro proteínas distintas. Aunque me ocuparé detalladamente de todos los pasos seguidos hasta su obtención en sus secciones correspondientes (apartados 2 a 5 de Materiales y Métodos), la estrategia general para la obtención de todas las estructuras es más o menos común y por ello en esta primera sección de Materiales y Métodos describiré el proceso general seguido.
1.1 Clonación de los genes de interés
Todas las manipulaciones del DNA se realizaron, excepto cuando se indique, de acuerdo con procedimientos bien establecidos recogidos en los “Current Protocols in Molecular Biology” (116).
1.1.1 PCR y purificación de amplificados. Los genes glnB y
argB de Synechococcus elongatus PCC 7942, que codifican para PII y
NAGK, se reclonaron desde plásmidos de expresión usados para ensayos de doble híbrido a plásmidos de expresión en E. coli. Para ello se amplificaron los genes mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando una DNA polimerasa de alta fidelidad termoestable y temperaturas de hibridación adecuadas para los cebadores y tiempos de extensión conformes a la longitud del gen. Los productos de PCR fueron precipitados en acetato amónico e isopropanol a -20 ºC, lavados con etanol al 70%, resuspendidos en agua miliQ estéril y conservados congelados a -20ºC.
1.1.2 Extracción de DNA plasmídico. Los plásmidos se
extrajeron mediante quits comerciales de extracción de DNA plasmídico (Marligen) basados en el método de la lisis alcalina.
1.1.3 Digestión de los plásmidos y de los productos de PCR y desfosforilación de los vectores. Los productos de PCR, así como los
plásmidos de expresión, se digirieron con los enzimas de restricción adecuados en cada caso, empleando los tampones y condiciones de digestión recomendadas por el proveedor. En todos los casos las reacciones de digestión se realizaron durante 3 horas a 37ºC. Una vez digeridos, los plásmidos fueron desfosforilados con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37 ºC, se purificaron con fenol:cloroformo, se precipitaron con acetato amónico e isopropanol, se lavaron con etanol al 70 % y finalmente se resuspendieron en agua miliQ estéril almacenándose a -20ºC.
1.1.4 Ligación, transformación y selección de transformantes.
En las reacciones de ligación se empleó la ligasa de DNA del bacteriófago T4 y el tampón de reacción suministrado por el proveedor.
Se probaron distintas proporciones plásmido:inserto (peso/peso) en el rango desde 1:1 hasta 1:8. Las reacciones de ligación se llevaron a cabo durante aproximadamente 12 horas a 14ºC tras las cuales se electroporaron células DH5α (Clontech) de E. coli electrocompetentes con 2μl de producto de ligación, que se sembraron en placas de LB agar conteniendo el antibiótico deseado y cuya resistencia la confiere el plásmido utilizado. La longitud del fragmento clonado se comprobó mediante PCR de las colonias crecidas en la placa y su secuencia mediante secuenciación automática (Servicio Secuenciación Instituto de Biomedicina de Valencia).
1.2 Sobreexpresión y purificación de proteínas recombinantes
1.2.1 Expresión de proteínas recombinantes en E. coli. En la
expresión de proteínas heterólogas en E. coli se utilizó el sistema de la T7 polimerasa. Se han empleado las cepas de E. coli (ambas de Novagen) BL21 (DE3) o para proteínas con baja expresión en BL21, Rosetta, que contienen el gen de la polimerasa T7 bajo el control de un promotor inducible por IPTG (isopropil β-D-tiogalactopiranosido). En el caso de proteínas con gran solubilidad, se expresaron a 37 ºC y a elevada concentración de IPTG (1 mM). En proteínas de menor solubilidad, la temperatura de expresión fue menor (18-25ºC), también la concentración de IPTG fue menor y en algún caso (NAGK) se requirió la co-expresión de la proteína con sobreexpresión simultanea de carabinas moleculares (GroEL/GroES).
1.2.2 Purificación de proteínas. Tres de las cuatro proteínas
purificadas (NAGK, PipX, NtcA) contenían una extensión de polihistidinas que permitió la purificación mediante cromatografía de afinidad mediante una columna de níquel en un sistema AKTA FPLC (GE Heaathcare) en un solo paso tras la sonicación de las células y centrifugación, aunque en NAGK sin embargo se usó además una precipitación con sulfato amónico previa al paso en el FPLC. Para PII, que
no tenía cola de poli-His, la fracción soluble fue sometida a distintos pasos de purificación, siguiendo protocolos estándar de fraccionamiento con sulfato amónico y de cromatografía (ver más adelante).
1.3.1 Preparación de complejos. Los complejos se prepararon a
partir de las proteínas purificadas de forma independiente, mezcladas en forma diluida y tras unos minutos de incubación, concentrados mediante ultrafiltración centrífuga.
1.3.2 Cristalización de proteínas. Se utilizó el método de gota
colgante para placas de 24 pocillos (1 ml de reservorio y 1+1 μl de de solución de proteína y solución de reservorio, sobre cubreobjetos de 22x22 mm previamente tratados con diclorometilsilano, que una vez invertidos se sellaron con grasa de alto vacío sobre cada uno de los pocillos) y el método de gota sentada para placas puestas con un robot Honeybee X8 (Genomic Solutions), en placas de 96 pocillos (Corning), mezclándose 0.4 μL de la solución de cada reservorio con 0.4 μL de la solución proteica. Se utilizaron distintos kits comerciales para cristalización (Hampton, Quiagen, Axygen, Sigma) y se observó de forma periódica a 60 aumentos con luz fria la evolución de los cristales. Tras la aparición de los primeros cristales, éstos se trataron de optimizar variando las concentraciones de precipitantes, mediante "seeding", adición de aditivos, etc.
1.3.3 Criopreservación. Para minimizar los efectos dañinos de
los rayos X al incidir sobre el cristal, las recogidas de datos de difracción se realizaron a una temperatura de 100 K (escala absoluta). Para evitar la formación de cristales de hielo que dañen los cristales, éstos se embebieron en soluciones crioprotectoras antes de la congelación.
1.3.4 Recogida y procesado de datos de difracción de rayos X.
Los datos de difracción de los cristales de esta tesis se han tomado en diferentes líneas del sincrotrón ESRF de Grenoble. El procedimiento habitual (117) con cada uno de los cristales fue muy similar. Inicialmente
se tomaron varias imágenes de difracción con las que se valoró la calidad del cristal y la resolución alcanzada. La posición de las reflexiones en estas imágenes se utilizó para determinar el grupo espacial, la orientación del cristal y su celda (proceso conocido como indexado). Esta información se utilizó para diseñar la estrategia de recogida (distancia del detector, ángulo de oscilación, tiempo de exposición y ángulo total de giro). Tras la recogida, se midió la intensidad de las reflexiones (integrado) y se escalaron los datos (es necesario debido a que existe redundancia de reflexiones, a que varias reflexiones están dispersas en varias imágenes y a posibles cambios en la intensidad de las reflexiones por ejemplo por decaimiento del cristal durante la recogida). Para uno de los cristales, el que contenía mercurio, los datos se recogieron a una longitud de onda a la cual la difracción anómala del mercurio es máxima.
1.3.5 Cálculo de la fase. Para obtener los mapas de densidad
electrónica es necesario conocer los factores de estructura, que contienen la información sobre la amplitud de la onda, pero también es necesario conocer la fase de la onda. La obtención de las fases es uno de los puntos de mayor dificultad en la resolución de una estructura. Hay varios métodos (117, 118) para resolver este problema, de entre los cuales en esta tesis se han utilizado dos: el reemplazo molecular y la dispersión anómala simple (SAD). El reemplazo molecular (“molecular replacement”) se emplea cuando se conoce la estructura de una macromolécula de estructura similar previamente resuelta. En estos casos, esta molécula se utiliza como modelo y se busca la posición del modelo que mejor explique las reflexiones observadas. La técnica de SAD se empleó para NtcA por la imposibilidad de obtener una buena solución de reemplazo molecular utilizando las estructuras conocidas de CRP como
modelo de búsqueda. La técnica de SAD se basa en la dispersión anómala que producen determinados átomos cuando son irradiados a longitudes de onda próximos a su máximo de absorción. El mercurio es uno de ellos y tiende a unirse a las cisteínas expuestas de una proteína.
1.3.6 Afinado y construcción del modelo. Una vez conocidas las
fases iniciales, calculamos mapas de densidad electrónica que se utilizaron para construir los modelos moleculares. Calculamos dos tipos de mapas: un mapa de densidad (2Fobs-Fcalc) que indica la estructura del
modelo, y un mapa de diferencias (Fobs-Fcalc), que indica los errores en la
posición de los átomos o la presencia de ligandos, iones y solvente no incluidos en el modelo inicial. Se intercalan luego sesiones de construcción de modelo de forma manual y programas de afinado que tienen en cuenta la posición de los átomos construidos y el mapa de densidad electrónica y la estereoquímica de la molécula. Durante el afinado, se calculó el factor estadístico de correlación R que indica las diferencias entre los factores de estructura experimentales (Fobs) y los
calculados a partir del modelo (Fcalc), además del factor Rfree similar al R,
pero calculado a partir de un 5 % de las reflexiones descartado al inicio del afinado.
1.3.7 Validación del modelo. Finalmente se comprueba que el
modelo no posee errores importantes, sobre todo de estereoquímica, y se depositan las estructuras y la información asociada en el Protein Data Bank (www.pdb.org), que posee a su vez varias herramientas para comprobar la calidad del modelo depositado.