El factor de transcripción NtcA

NtcA es un factor de transcripción cianobacteriano perteneciente a la familia CRP/FNR (2, 97). Se le conoce como el regulador global del nitrógeno pues controla la expresión de hasta cientos de genes dependiendo de la especie de cianobacteria, genes relacionados con el metabolismo del nitrógeno, aunque también controla genes del metabolismo de azúcares, fotosintéticos o de defensa antioxidante entre otros (2, 68). NtcA es una proteína de 222 aminoácidos. Tiene distribución universal en cianobacterias. Se une a una secuencia consenso GTAN8TAC (2, 98) o al menos a la secuencia esencial GTN10AC (99)

parte de los casos NtcA actúa como activador, y en unos pocos casos como represor (2, 68, 91, 99, 100). Cuando actúa como represor, su sitio de unión se sitúa cercano al lugar de inicio de la transcripción impidiendo la unión de la RNA polimerasa al promotor. Cuando lo hace como activador, en muchos promotores el sitio consenso está centrado a -41.5 nucleótidos del lugar de inicio de la transcripción tal y como ocurre con los promotores bacterianos de clase II (101).

La transcripción dependiente de NtcA se activa en presencia de fuentes pobres en nitrógeno. Activa su propia expresión, expresándose a niveles basales en presencia de amonio y aumentando su transcripción en su ausencia (98). Al igual que con PII, de nuevo es el 2OG la molécula

implicada en la señalización, pues tiene un efecto positivo directo sobre la transcripción génica mediada por NtcA (102-104), además de favorecer la unión de PipX a NtcA (60).

5.4.1 Familia CRP/FNR de factores de transcripción. La

comparación de secuencias demuestra que NtcA pertenece a la familia de factores de transcripción CRP/FNR (2). Estos factores de transcripción son proteínas de unión a DNA que funcionan habitualmente como activadores transcripcionales y que se encuentran ampliamente distribuidos en procariotas. Engloban a cientos de miembros que se agrupan en las subfamilias ArcR, CooA, CprK, Crp, Dnr, FixK, Fnr, MalR, NnR, NtcA, PrfA y YeiL (97). Pese a la existencia de un gran número de factores de transcripción en bacterias, una proporción elevada de genes está controlada sólo por miembros de la familia CRP/FNR y en muchos casos la expresión de otros factores de transcripción está bajo el control de CRP/FNR (101, 105).

Los factores de esta familia responden a un amplio espectro de señales ambientales como pueden ser el cAMP, 2OG, anoxia, estado redox, monóxido de carbono, temperatura, óxido nítrico, etc. Se caracterizan por poseer dos dominios: un dominio sensor N-terminal y un dominio C-terminal de unión a DNA con un motivo hélice-giro-hélice (Fig. 10). De los miembros de la familia, el más conocido y el mejor caracterizado de ellos es CRP (cAMP receptor protein) o también llamado CAP (catabolite activator protein).

Fig. 10. Estructura del factor de transcripción CRP. Formas (A) activa (código PDB

1G6N), con cAMP unido, (B) inactiva (código PDB 3HIF) y (C) unida a DNA con cAMP unido (código PDB 1J59) de CRP de E. coli. Cada subunidad coloreada de forma diferente y con el dominio C-terminal de unión a DNA en una tonalidad más oscura.

5.4.2 Estructura de CRP: mecanismo de activación por cAMP, unión a DNA y activación de la transcripción. La proteína CRP

representa el paradigma de un regulador génico, cuya estructura, resuelta el año 1981 (106), fue la primera para un activador transcripcional. De CRP se han resuelto las estructuras (Fig. 10) de la forma activa unida a cAMP (106, 107), de formas sin ligando en conformaciones inactivas (108, 109) y de la forma activa unida a DNA (110, 111). CRP es un dímero de 209 aminoácidos por subunidad. Los dominios sensor y de

unión a DNA están conectados por una larga α-hélice (hélice C) interfacial. Tras la unión del cAMP al dominio sensor de cada subunidad, CRP sufre una transición desde un estado inactivo con baja afinidad para unir DNA (108, 109), a un estado activo donde las hélices de reconocimiento del DNA (hélices F) interaccionarían con dos surcos mayores consecutivos del DNA, justo donde se encuentran las secuencias génicas específicas reconocidas por CRP (110, 111), donde varios residuos conservados de CRP interaccionan con las bases nitrogenadas del DNA. Las demás interacciones son con los grupos fosfato del DNA. Tras la unión, CRP curva el DNA aproximadamente 90º (Fig. 10C).

En los promotores activados por CRP la secuencia a la que se une CRP puede estar centrada en dos lugares principalmente, a -61.5 o a -41.5 nucleótidos del lugar de inicio de la transcripción. Cuando se une en -61.5 hablamos de promotores de clase I, mientras que son de clase II (los mayoritarios) cuando lo hace en -41.5 (101, 112, 113). En los de clase I, tras la unión de CRP a su sitio en el promotor, CRP podría activar la transcripción al reclutar a la RNA polimerasa (RNAP) al lugar de inicio de la transcripción por interacción directa de la subunidad de CRP más distal (sobre el DNA) con el dominio C-terminal de la subunidad α de la RNAP (α-CTD; la composición del holoenzima de una RNAP bacteriana es ββ’α2ωσ). En los de clase II (Fig. 11), tras la unión de CRP a su sitio

en el promotor, CRP podría activar la transcripción a dos niveles, el primero de ellos al reclutar a la RNAP por interacción directa de la subunidad de CRP más proximal con α-CTD, y el segundo en un paso posterior, al favorecer la tasa de isomerización de complejo cerrado a abierto de la RNAP (etapa en la cual se separan ambas hebras del DNA para formar la burbuja de transcripción), y esto lo hace probablemente

gracias a los contactos de la subunidad más distal de CRP con las subunidades σ y el dominio N-terminal de la subunidad α de la RNAP (101, 112, 113) (Fig. 11).

Fig. 11. Activación de la transcripción en promotores bacterianos de clase II. En la

activación de la transcripción están implicados tres series de contactos entre el factor de transcripción (CAP en la figura) y la RNAP (resto de componentes proteicos representados), más concretamente con las subunidades α-CTD, α-NTD y la subunidad σ (círculos en color). El DNA se representa linealmente con las secuencias de reconocimiento de CAP a -41.5, y los del promotor a -35 y -10, señalando con una flecha el origen de transcripción. Uno de los dos α-CTDs del dímero de la subunidad α queda libre [Tomado de (112)].

5.4.3 Activación de NtcA por 2OG: unión a DNA y activación de la transcripción. NtcA “in vitro” es capaz de unir DNA en ausencia

de 2OG pero no parece ser capaz de activar la transcripción (102, 104). La presencia de 2OG favorece la unión de NtcA al DNA y parece indispensable para la activación de la transcripción (102, 104). De hecho, NtcA en presencia de 2OG activa la transcripción de la misma forma que lo hace CRP en los promotores de clase II, favoreciendo por una parte el reclutado de la RNAP y por otra parte favoreciendo la isomerización de complejo cerrado a abierto de la RNAP. Por lo tanto se espera que NtcA contacte a la RNAP de la misma forma que lo hace CRP (104). De forma más específica, parece que para los genes estudiados (104) la unión del 2OG a NtcA es indispensable para la etapa de isomerización de complejo cerrado a abierto de la RNAP, además de aumentar la afinidad de NtcA

por el DNA y permite a NtcA reclutar con mayor eficiencia a la RNAP sobre el promotor, ya que aunque la RNAP es capaz de unirse al promotor en ausencia del factor de transcripción, lo hace con muy baja afinidad (104).

5.5 El complejo NtcA-PipX: Co-activación de la transcripción