Amplificación del vector gutless

Para amplificar Ad gutless existen distintas variables que se han de tener en cuenta. Entre otras: a) diferentes vectores helper según sus secuencias de recombinación o genes marcadores, b) diferentes líneas celulares con o sin recombinasas, c) diferentes cantidades de plásmido a transfectar, d) diferentes concentraciones de virus a administrar y e) diferentes tiempos de producción para los distintos pasos de amplificación.

Para amplificar el vector pKCZ (β-gal), el vector helper utilizado fue Ad5/FC31.Cre mientras que para amplificar el vector pFK7 el vector utilizado fue Ad5/FC31.Cre-RFPc. attP

Ad5/Cre.FC31-RFPm

Ad5/Cre.FC31-RFPc

En los primeros pasos de producción, la capacidad de amplificación del plásmido helper está disminuida considerablemente en comparación a los Ad controles. Si la secuencia attB es la principal o única responsable del retraso viral, en los primeros pasos de amplificación no hace falta utilizar líneas celulares con recombinasas, con lo que se evita, de este modo, la selección positiva de mutantes para las secuencias de recombinación por el uso de la recombinasa, problema de especial importancia ya conocido durante la generación de Ad gutless por el sistema Cre-loxP. Por ello, en el primer paso de amplificación se utilizará la línea HEK293.

El tiempo de producción no debe ser elevado para dificultar así el empaquetamiento del Ad helper. Sin embargo, debe de ser el suficiente para permitir la producción del Ad gutless con la mínima contaminación de Ad helper.

Cuando se inicia la producción del Ad gutless, generalmente se utiliza una co- transfección de plásmidos como primer paso de amplificación. Alternativamente, se puede utilizar también una infección con Ad helper. La cantidad de Ad helper no debería ser superior a una MOI=5 ya que esta dosis es suficiente para infectar el 80-90% de las células y no debería ser inferior a una MOI=1 ya que se perdería parte de la producción de Ad gutless si no se consigue aportar los Ad helper suficientes. En los siguientes pasos de amplificación, la dosis de Ad helper que se debe de administrar dependerá del aporte de Ad helper que provenga del paso anterior.

4.2.1 Producción de Ad gutless en función de la dosis de plásmido utilizado

En experimentos previos, se determinó la cantidad de 6 microgramos de ADN como la cantidad idónea para transfectar 1E6 células HEK293 mediante PEI. Para determinar la relación óptima entre los plásmidos pKCZ y pAd5/FC31.Cre se transfectaron diferentes dosis en relación Helper:Gutless de 1:5, 3:3 y 5:1 en células HEK293 durante 36 horas (n=3).

Figura 44. Título infeccioso del plásmido pKCZ con el plásmido pAd5/FC31.Cre crecido en

HEK293 durante 36 horas

Los resultados de transfección indicaron que la relación helper:gutless óptima es de 3:3 (figura 44). Asimismo, se pudo observar que el Ad helper es capaz de aportar las proteínas virales necesarias para producir Ad gutless en las primeras 36 horas de su ciclo viral, incluso desde la transfección de plásmidos. Además, como ya se había predicho, la producción de Ad helper, desde plásmido, a las 36 horas fue nula. Para asegurar que en este primer paso no se generaba ninguna partícula Ad helper infecciosa, se analizó toda la muestra sobre 1E6 células.

4.2.2 Transfección de Ad gutless a las 40 y 60 horas

Para comprobar la importancia del tiempo en la producción de Ad gutless, se estudió si la concentración de Ad gutless aumentaba a un número mayor de horas. Así, se transfectaron los plásmidos pKCZ y pAd5/FC31.Cre con relación 3:3 en 1E6 células HEK293 (n=3). Las muestras fueron recogidas a las 40 y 60 horas, pasaron por 3 ciclos de congelación/descongelación y fueron tituladas (todo el contenido) sobre 1E6 células.

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 H1:G5 H3:G3 H5:G1 IU _Ad5/FC31.Cre KCZ

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Ad5/FC31.Cre 40h KCZ 40h Ad5/FC31.Cre 60h KCZ 60h IU t o ta le s

Figura 45. Producción de pKCZ (gutless) con el plásmido pAd5/FC31.Cre (helper) crecido

hasta las 40 y 60 horas en células HEK293.

Como muestra la figura 45, el plásmido pAd5/FC31.Cre permite la producción de partículas infecciosas de Ad gutless KCZ sin promover la generación de partículas infecciosas de Ad5/FC31.Cre a las 40 horas, tal y como se había observado en la figura 44. Además, a las 60 horas, la cantidad de Ad gutless aumenta 5 veces respecto a las 40 horas y es 50 veces mayor al Ad helper Ad5/FC31.Cre.

De igual modo, se utilizaron los plásmidos pAd5/FC31.Cre-RFPc y el pFK7 con resultados similares a los encontrados en la figura 45. Con estos plásmidos se pudo visualizar, por microscopía de fluorescencia, la propagación de ambos vectores al mismo tiempo.

4.2.3 Amplificación de Ad gutless desde plásmido y virus

Para saber si el Ad gutless podría ser amplificado con mayor eficiencia con la administración de virus helper, se realizó un experimento de transfección de los plásmidos pKCZ + pAd5/FC31.Cre con una relación 3:3. Asimismo, en paralelo, se realizó una transfección de 3 microgramos del plásmido pKCZ más virus Ad5/Cre.FC31 con una MOI=5 (n=2). Las muestras fueron recogidas a las 40 horas y tituladas bien por dilución límite en el caso del experimento con

virus, bien toda la muestra sobre 1E6 células HEK293 en el caso de la co- transfección de plásmidos. 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 Ad5/FC31.Cre 40h KCZ 40h IU t o ta le s Ad5/FC31.Cre plásmido Ad5/FC31.Cre virus

Figura 46. Amplificación diferencial del plásmido pKCZ con el virus y plásmido helper

Ad5/FC31.Cre.

La figura 46 muestra que el uso del virus helper no es beneficioso para la producción de Ad gutless, incluso a las 40 horas, ya que aunque genera prácticamente el mismo número de partículas infecciosas gutless que el plásmido helper, permite la generación de partículas helper infecciosas.